本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選口腔扁平苔蘚唾液差異蛋白

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【摘要】：目的：口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種常見的口腔黏膜疾病，病因不明，易反復(fù)發(fā)作，有一定的癌變傾向，被世界衛(wèi)生組織（WHO）定義為癌前狀態(tài)。在我們前期研究中，應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出142個差異表達(dá)基因，而基因是通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來進(jìn)行表達(dá)。隨著人類基因組測序計劃的完成，研究重點逐漸轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，然而僅憑基因DNA序列及其表達(dá)仍不足以解決基因表達(dá)時間及表達(dá)量甚至蛋白質(zhì)的翻譯后加工及修飾等情況，因此，這些基因組學(xué)不能解決的問題可以在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中找到答案。目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其研究越來越多地應(yīng)用到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域，尤其是在研究疾病的病因及發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。以往采用雙向凝膠電泳技術(shù)研究扁平苔蘚差異蛋白的方法誤差較大，蛋白定量不準(zhǔn)確，而且蛋白質(zhì)組學(xué)對組織和血液研究較多，對唾液的研究較少。而唾液取材的簡便、安全、低成本和無創(chuàng)性以及含有許多有助于疾病早期診斷的蛋白質(zhì)，使得唾液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展受到人們的關(guān)注，但是由于唾液的蛋白質(zhì)種類較多，蛋白質(zhì)濃度相差較大，對于唾液蛋白的提取沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，還需要進(jìn)一步探索。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)篩選、鑒定與口腔扁平苔蘚患者唾液有關(guān)的差異蛋白，以探討唾液中某些相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化與口腔扁平苔蘚發(fā)生的可能作用機(jī)制。 方法： 1提取唾液蛋白預(yù)試驗 分別采用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法及2-D Clean-Up Kit的方法提取新鮮唾液蛋白，并將苯酚抽提復(fù)溶后的蛋白經(jīng)超聲處理50s，通過觀察十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶，確定提取唾液蛋白的最適方法。 2唾液蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 收集9例口腔扁平苔蘚患者及9例正常人唾液，為了減少個體差異對__________________________________________________________________________________________________本研究的影響，分別將每組3例唾液混合，作為一個試驗樣品。按照2-DClean-Up Kit說明書操作提取唾液總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶觀察唾液蛋白的提取情況。 3雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)、質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白 采用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，Typhoon9410掃描獲取電泳圖譜，DecyderTM2D6.5軟件尋找差異蛋白質(zhì)點，將凝膠進(jìn)行Deeppurple染色，然后用Ettan Spot Picker將差異蛋白質(zhì)點從凝膠中切下，胰酶酶解，應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）對差異蛋白質(zhì)點進(jìn)行分析，將生成的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Bio Works3.3.1數(shù)據(jù)分析軟件中的SEQUEST算法進(jìn)行計算，在NCBI中搜索數(shù)據(jù)庫，鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果： 1預(yù)試驗結(jié)果 預(yù)試驗應(yīng)用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法提取唾液蛋白，用DIGEbuffer復(fù)溶后均有粘稠透明膠狀物出現(xiàn)，且甲醇/NH4HCO3沉淀法提取蛋白后蛋白有明顯的丟失現(xiàn)象，將膠狀物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后出現(xiàn)蛋白條帶，說明唾液蛋白復(fù)溶時并沒有完全溶解到DIGEbuffer中，為了增加唾液蛋白的溶解度，將苯酚抽提蛋白復(fù)溶后經(jīng)超聲處理50s，測定蛋白濃度，盡管蛋白濃度有所上升，但仍有膠狀物存在，唾液蛋白并沒有完全溶解。而經(jīng)2-D Clean-Up Kit提取蛋白，DIGE buffer復(fù)溶蛋白后，沒有發(fā)現(xiàn)膠狀物的存在，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示各樣品條帶清晰，無明顯蛋白質(zhì)丟失、降解。2-D Clean-UpKit適合唾液蛋白質(zhì)的提取。 2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果 口腔扁平苔蘚患者組和正常人組用2-D Clean-Up Kit提取唾液蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示蛋白條帶清晰，沒有明顯蛋白丟失和降解。 3雙向熒光差異凝膠電泳結(jié)果 雙向熒光差異凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，圖像重復(fù)性較好、分辨率較高，蛋白質(zhì)等電點和分子量分布范圍較廣。DecyderTM2D6.5軟件分析扁平苔蘚患者組和正常人組唾液差異蛋白質(zhì)點數(shù)平均為317±71個，，并用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)鑒定了重復(fù)性較好的4個差異蛋白質(zhì)點，分別為分泌型IgA1、鋅α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白，它們在OLP患者唾液中表達(dá)量均上調(diào)。 結(jié)論： 12-D Clean-Up Kit適合唾液蛋白質(zhì)的提取。 2口腔扁平苔蘚患者唾液中存在差異蛋白表達(dá)，其中分泌型IgA1、鋅α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白在口腔扁平苔蘚患者中表達(dá)上調(diào)，提示它們可能參與了口腔扁平苔蘚的發(fā)生、發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：口腔扁平苔蘚 唾液 蛋白質(zhì)組學(xué) 雙向熒光差異凝膠電泳 液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R781.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料與方法11-22
• 結(jié)果22-24
• 附圖24-28
• 附表28-29
• 討論29-30
• 結(jié)論30-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 綜述 唾液蛋白質(zhì)組學(xué)在口腔扁平苔蘚研究中的應(yīng)用34-44
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 致謝44-45
• 個人簡歷45

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：549959