本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建含有間充質(zhì)干細(xì)胞和外泌體的脫細(xì)胞組織水凝膠用于修復(fù)大體積肌肉缺損的實驗研究

  更多相關(guān)文章： 骨骼肌缺損 組織工程 脫細(xì)胞組織 間充質(zhì)干細(xì)胞 促血管化 外泌體

【摘要】：由于遺傳疾病、發(fā)育異常、腫瘤手術(shù)切除或外傷所導(dǎo)致的大體積顱頜面骨骼肌缺損一直以來影響著患者口頜功能的完整和面部外形的美觀,現(xiàn)在臨床常用的修復(fù)方法包括采用各種無生物活性材料制作的贗復(fù)體及游離或帶締肌皮瓣的移植,但這些治療手段均具有一些局限性,如無法恢復(fù)肌肉伸縮功能、移植手術(shù)對于缺損部位的特定要求或供體部位組織的損傷等,因此高效的、無損的獲得缺損肌肉組織功能與外形的完整修復(fù)成為了該領(lǐng)域所有醫(yī)者追逐的目標(biāo)。近年來隨著生命科學(xué)與其他相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展與融合,組織工程技術(shù)作為一門交叉學(xué)科越來越受到人們的重視,在肌肉缺損修復(fù)領(lǐng)域也得到了廣泛的關(guān)注。組織工程修復(fù)肌肉缺損就是利用生物相容性良好的支架材料將具有形成肌纖維潛力的細(xì)胞導(dǎo)入肌肉缺損處,這些細(xì)胞通過自體分化或分泌誘導(dǎo)因子使得肌肉纖維在缺損區(qū)域再生并行使功能,從而達(dá)到修復(fù)肌肉組織的目的。迄今為止已經(jīng)有多種基于不同支架材料和祖細(xì)胞或干細(xì)胞的研究方法應(yīng)用于該領(lǐng)域,然而由于誘導(dǎo)微環(huán)境的缺乏或移植區(qū)域血供營養(yǎng)不足等原因,大體積肌肉缺損仍無法得到有效地修復(fù)。因此,為了解決這些問題,我們基于已有的研究成果,構(gòu)建出一種由組織特異性的脫細(xì)胞水凝膠和具有肌向分化潛能的間充干細(xì)胞構(gòu)成的修復(fù)體,并復(fù)合了具有促血管生成能力的外泌體,用于修復(fù)大體積肌肉缺損。首先,我們分離、培養(yǎng)和鑒定了大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(r UCMSCs),并制作了脫細(xì)胞豬骨骼肌組織水凝膠(p DMH),通過細(xì)胞計數(shù)和活/死細(xì)胞染色觀察r UCMSCs在該生物水凝膠內(nèi)的生長、增殖情況,篩選p DMH的最佳使用濃度。然后通過基因蛋白檢測以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察p DMH對于r UCMSCs成肌分化的促進(jìn)作用。其次,我們培養(yǎng)并鑒定了大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(r UVECs),然后通過劃痕實驗、Transwell透膜實驗、染色、成管腔實驗以及成血管相關(guān)基因蛋白檢測對比了r UCMSC在常氧或低氧培養(yǎng)條件下所分泌的物質(zhì)對r UVECs增殖、遷移以及成血管的能力的影響。在此基礎(chǔ)上,我們提取了低氧條件培養(yǎng)下的r UCMSCs產(chǎn)生的外泌體(exosome),并研究了不同濃度該外泌體對于r UVECs增殖,遷移及成血管能力的影響,確定了exosome的最佳使用濃度。隨后在大鼠皮下移植了含有一定濃度exosomes的MatrigelTM基質(zhì)膠,觀察其短期促進(jìn)血管生成的能力。最后,我們構(gòu)建了含有r UCMSCs和低氧條件下r UCMSCs分泌的exosomes的脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠用于修復(fù)大鼠脛骨前肌大體積缺損,并對其短期及長期的修復(fù)效果進(jìn)行了組織學(xué)及功能學(xué)檢測。實驗結(jié)果證明,脫細(xì)胞豬心肌組織水凝膠所構(gòu)成的三維培養(yǎng)系統(tǒng)可以有效支持r UCMSCs的生長、增殖,并且對細(xì)胞肌向分化具有顯著的促進(jìn)作用。此外,處于低氧條件中的r UCMSCs所分泌的exosomes在一定濃度下能夠明顯提高r UVECs的增殖,遷移及體外成血管能力,并在體內(nèi)促進(jìn)了新生血管的生成。而含有這種exosomes和r UCMSC的脫細(xì)胞組織水凝膠修復(fù)體在修復(fù)大鼠脛骨前肌大體積缺損時取得了令人滿意的效果,為口腔頜面部肌肉大體積缺損的修復(fù)提供了一種新的策略。
【關(guān)鍵詞】：骨骼肌缺損 組織工程 脫細(xì)胞組織 間充質(zhì)干細(xì)胞 促血管化 外泌體
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R782.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-16
• 文獻(xiàn)回顧16-35
• 第一部分 脫細(xì)胞組織生物水凝膠的構(gòu)建及其對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長、增殖和肌向分化的影響35-55
• 1 材料35-38
• 1.1 主要試劑與儀器35-37
• 1.2 材料37
• 1.3 實驗動物37-38
• 2 方法38-46
• 2.1 豬來源脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠（p DMH）的制備38-40
• 2.2 大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（r UCMSCs）分離培養(yǎng)及鑒定40-41
• 2.3 不同濃度脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠對于r UCMSCs生長、增殖的影響41-42
• 2.4 脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠對于r UCMSCs肌向分化的促進(jìn)作用42-46
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析46
• 3 結(jié)果46-53
• 3.1 脫細(xì)胞骨骼肌的制備46-48
• 3.2 脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠的制備與檢測48
• 3.3 大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定48-50
• 3.4 脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠對于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長與增殖的影響50-51
• 3.5 脫細(xì)胞骨骼肌水凝膠對于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成肌能力的影響51-53
• 4 討論53-54
• 5 小結(jié)54-55
• 第二部分 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在體內(nèi)、體外對血管生成的促進(jìn)作用55-76
• 1 材料55-57
• 1.1 主要試劑和儀器55-57
• 1.2 材料57
• 1.3 實驗動物57
• 2 方法57-65
• 2.1 大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（r UVECs）的分離培養(yǎng)與鑒定57-58
• 2.2 大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響58-61
• 2.3 大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體（r UCMSCs-Exosome）對大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響61-63
• 2.4 rUCMSCs-Exosome對于體內(nèi)成血管的影響63-65
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析65
• 3 結(jié)果65-73
• 3.1 大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定65-66
• 3.2 大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對于大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響66-69
• 3.3 來源于低氧條件下大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體對于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響69-72
• 3.4 來源于細(xì)胞低氧條件培養(yǎng)液的外泌體體內(nèi)促進(jìn)血管生成的作用72-73
• 4 討論73-74
• 5 小結(jié)74-76
• 第三部分 含有促血管生成外泌體的脫細(xì)胞外基質(zhì)-間充質(zhì)干細(xì)胞生物水凝膠修復(fù)大鼠脛骨前肌大體積缺損76-89
• 1 材料76-77
• 1.1 主要試劑與儀器76-77
• 1.2 材料77
• 1.3 動物77
• 2 方法77-80
• 2.1 組織工程生物水凝膠修復(fù)體的制備77-78
• 2.2 大鼠脛骨前肌（TA）大體積缺損修復(fù)78-79
• 2.3 組織學(xué)檢測79
• 2.4 功能學(xué)檢測79-80
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析80
• 3 結(jié)果80-86
• 3.1 組織工程生物水凝膠修復(fù)的制備80-81
• 3.2 脛骨前肌大體積缺損修復(fù)效果81-86
• 4 討論86-88
• 5 小結(jié)88-89
• 結(jié)論89-91
• 參考文獻(xiàn)91-116
• 附錄116-118
• 個人簡歷和研究成果118-120
• 致謝120

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