本文關(guān)鍵詞：Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建中作用的初步研究

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【摘要】：研究背景根尖周炎是一種多由微生物感染引起的發(fā)生在牙根尖周組織的炎癥性疾病。臨床上,對(duì)于發(fā)生根尖周炎的牙齒,需進(jìn)行根管治療,而年輕恒牙治療方法還包括氫氧化鈣根尖誘導(dǎo)成形術(shù)和現(xiàn)在臨床上較常用的MTA根尖屏障術(shù)。但根尖誘導(dǎo)成形術(shù)時(shí)間和效果不確定,根尖屏障術(shù)雖然可以提高患者的依從性,提高了治愈的概率,但很難使牙根得到完全發(fā)育。短而薄弱的牙根會(huì)增加后續(xù)折裂的可能性。年輕恒牙根尖周炎的治療,預(yù)期達(dá)到的結(jié)果應(yīng)包括治愈根尖周炎癥、促進(jìn)牙根的繼續(xù)發(fā)育及牙髓組織的功能性(組織學(xué)和感覺)修復(fù)的完成。然而目前治療方案很難達(dá)到這一目標(biāo),僅能在治愈根尖周炎癥這一方面有所保障。臨床研究和一系列病例報(bào)道均表明,牙髓壞死伴根尖周炎的年輕恒牙經(jīng)過嚴(yán)格根管消毒、刺激根尖周血液進(jìn)入根管和嚴(yán)密冠部充填,可能夠使得牙根繼續(xù)發(fā)育,X線表現(xiàn)為牙根長(zhǎng)度增加、根管壁增厚、根尖孔逐漸閉合以及根尖病變消失,這一治療方法稱為“牙髓血運(yùn)重建”(pulp revascularization)。根尖周病的發(fā)生、發(fā)展以及牙髓血運(yùn)重建的過程是多重因素交互作用,機(jī)制非常復(fù)雜的過程,對(duì)其機(jī)制存在許多假設(shè)尚未形成成熟的理論,有待進(jìn)一步研究。研究根尖周炎的發(fā)病機(jī)制,尤其是各種細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子在根尖周炎中的作用,一直以來都是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,以Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路介導(dǎo)Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,被認(rèn)為是迄今為止細(xì)胞抗氧化機(jī)制中發(fā)現(xiàn)的最重要的通路。許多疾病的發(fā)生都與氧化應(yīng)激相關(guān),Keap1-Nrf2-ARE通路的抗氧化作用廣泛,可以保護(hù)多種細(xì)胞,在許多疾病中起到重要作用,其中包括惡性腫瘤、帕金森病、阿爾茨海默病、糖尿病等。近年來發(fā)現(xiàn)其在炎癥的抑制中也能起到重要作用。研究表明Keapl-Nrf2-ARE信號(hào)通路參與削弱炎癥相關(guān)病理過程。此外,Nrf2還有促血管形成的功能。研究表明,Nrf2與血管的形成修復(fù)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)、增殖、分化、遷移以及血管形成能力相關(guān)。Nrf2與口腔疾病相關(guān)的研究較少。近年來學(xué)者研究表明Keapl-Nrf2-ARE通路的激活可能抑制牙齦卟啉單胞菌LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎的發(fā)展等。根尖周炎的發(fā)生發(fā)展是炎癥相關(guān)病理過程,牙髓血運(yùn)重建過程,是一個(gè)在炎癥控制的條件下根管內(nèi)新生組織長(zhǎng)入的過程,而新生組織的生存離不開血運(yùn)的重建,故推測(cè)Nrf2在根尖周炎的發(fā)展以及牙髓血運(yùn)重建過程也可能起到一定作用。綜上所述,Nrf2是一種在細(xì)胞保護(hù)、炎癥控制及血管形成中均有可能起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子,但由于倫理道德上存在局限性,在人體內(nèi)難以檢測(cè)其在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)過程。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,測(cè)定Nrf2在炎癥及組織愈合過程中分布及表達(dá)量隨時(shí)間變化的規(guī)律,為探索根尖周炎愈合及牙髓血運(yùn)重建的機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。研究目的本實(shí)驗(yàn)擬通過建立小鼠根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建模型,研究Nrf2在根尖周炎發(fā)展及牙髓血運(yùn)重建組織新生過程中的影響,為研究根尖周炎發(fā)生發(fā)展及牙髓血運(yùn)重建機(jī)制提供一定理論依據(jù)。材料與方法第一部分 小鼠下頜第一磨牙根尖周炎模型的建立20只3周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)選取10只作為實(shí)驗(yàn)組,另外10只作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠下頜第一磨牙從冠部開髓,髓腔開放于口腔環(huán)境3周。于術(shù)后3周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分離下頜骨,進(jìn)一步進(jìn)行組織學(xué)、影像學(xué)及熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫頸處死,分離下頜骨,固定24 h,使用Micro-CT成像系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本逐個(gè)進(jìn)行斷層掃描成像,用于后續(xù)觀察分析。掃描過后標(biāo)本制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色。將實(shí)驗(yàn)組另外5只小鼠脫頸處死,提取根尖周及根管內(nèi)組織總RNA, qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子IL-1、IL、TNF-α mRNA表達(dá)情況,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。第二部分小鼠下頜第一磨牙牙髓血運(yùn)重建模型的建立30只3周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)選取20只作為實(shí)驗(yàn)組(10只使用流動(dòng)樹脂行冠部充填,10使用玻璃離子水門汀行冠部充填),另外10只作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠下頜第一磨牙從冠部開髓,使用6#、8#K銼疏通根管,去除牙髓,并將K銼超出根尖孔,刺激根尖周組織出血至根管口水平,待血凝塊形成后,使用MTA覆蓋整個(gè)血凝塊面。其中10只小鼠使用玻璃離子水門汀(GIC)進(jìn)行冠部充填,另外10只小鼠使用流動(dòng)樹脂進(jìn)行冠部充填,記錄手術(shù)時(shí)間。術(shù)后3周檢查牙髓血運(yùn)重建組充填物脫落情況,對(duì)兩組手術(shù)時(shí)間及充填物脫落率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分離下頜骨,同實(shí)驗(yàn)一方法進(jìn)一步進(jìn)行組織學(xué)、影像學(xué)分析及qRT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)情況。第三部分Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中表達(dá)的研究10只3周齡C57BL/6小鼠進(jìn)行脫頸處死,分離下頜骨,置于4%中性多聚甲醛中固定24 h,使用防脫片制作石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色,檢測(cè)Nrf2表達(dá)情況。20只小鼠,左側(cè)下頜第一磨牙行牙髓血運(yùn)重建術(shù),右側(cè)下頜第一磨牙將牙髓腔直接開放于口腔環(huán)境3周,造成實(shí)驗(yàn)性根尖周炎。于術(shù)后1、4周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分離下頜骨,進(jìn)一步進(jìn)行HE染色、影像學(xué)掃描。提取組織總RNA,根尖周炎組qRT-PCR檢測(cè)Nrf2、ILβ、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)情況,牙髓血運(yùn)重建組檢測(cè)Nrf2、VEGF mRNA表達(dá)情況,未經(jīng)處理的小鼠作為對(duì)照組,檢測(cè)以上所有因子。根尖周炎組及牙髓血運(yùn)重建組各時(shí)間點(diǎn)分別選取與HE染色結(jié)果連續(xù)的切片進(jìn)行免疫組化染色,觀察Nrf2表達(dá)變化。結(jié)果1.建立小鼠下頜第一磨牙根尖周炎模型實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物一般狀況良好,未觀察到明顯牙體折裂或松動(dòng)。Micro-CT顯示,術(shù)后3周根尖周炎組下頜第一磨牙可觀察到根尖周骨質(zhì)破壞。組織學(xué)結(jié)果表明,根管內(nèi)充滿壞死物質(zhì),根尖周大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.05)。2.建立小鼠下頜第一磨牙牙髓血運(yùn)重建模型術(shù)后3周,牙髓血運(yùn)重建組部分牙冠部充填物脫落。與流動(dòng)樹脂組相比,玻璃離子水門汀組手術(shù)耗時(shí)較少,且充填物脫落率低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Micro-CT顯示,牙鏈血運(yùn)重建組下頜第一磨牙牙冠可見高密度充填物影像,封閉根管口,根管腔縮窄,管壁增厚,根尖部膨大,有新生硬組織形成,根尖孔縮小。組織學(xué)分析表明,管腔有血管化的新生組織長(zhǎng)入,根尖部有骨樣及軟骨樣組織沉積,VEGF mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.05)。3.Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中表達(dá)的變化正常情況下,Nrf2在牙髓及根尖周組織中表達(dá)較少,表達(dá)部位主要在胞漿。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Nrf2陽性細(xì)胞都有所增加,胞漿與胞核都存在Nrf2表達(dá),且胞核Nrf2表達(dá)大大增加。根尖周炎組中術(shù)后1周Nrf2陽性細(xì)胞多于術(shù)后4周,根管內(nèi)及根尖周炎癥區(qū)域可見Nrf2呈陽性表達(dá),主要位于淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中,細(xì)胞呈圓形或橢圓形,胞漿或胞核呈棕黃色深染,根管內(nèi)成纖維細(xì)胞也可見Nrf2陽性表達(dá)。牙髓血運(yùn)重建組中術(shù)后4周Nrf2陽性細(xì)胞多于術(shù)后1周,可見根管內(nèi)及根尖周組織Nrf2呈陽性表達(dá),主要為形狀不規(guī)則的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)成功建立小鼠下頜第一磨牙根尖周炎模型,并采用影像學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)根尖周炎模型進(jìn)行評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,根尖周炎組根尖周病損形成,該模型的成功建立可便于進(jìn)一步研究根尖周炎炎癥發(fā)展機(jī)制。2.本實(shí)驗(yàn)成功建立并評(píng)價(jià)小鼠下頜第一磨牙去髓后血運(yùn)重建模型,且認(rèn)為玻璃離子水門汀更適用于術(shù)后冠部充填。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,牙髓血運(yùn)重建組可觀察到新生組織形成,根尖繼續(xù)發(fā)育,該模型的成功建立可便于進(jìn)一步研究牙髓血運(yùn)重建機(jī)制。3.小鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中,Nrf2的表達(dá)顯著增加,且表達(dá)量與時(shí)間相關(guān),說明Nrf2在根尖周炎炎癥控制及牙髓血運(yùn)重建組織新生修復(fù)過程中具有一定作用,但機(jī)體作用機(jī)制不明確,需進(jìn)一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：小鼠 牙髓血運(yùn)重建 根尖周炎 Micro-CT 炎癥因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.341
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-19
• 第一章 小鼠下頜第一磨牙根尖周炎模型的建立19-30
• 1 材料與方法19-26
• 2 結(jié)果26-28
• 3 討論28-30
• 第二章 小鼠下頜第一磨牙牙髓血運(yùn)重建模型的建立30-40
• 1 材料與方法30-34
• 2 結(jié)果34-37
• 3 討論37-40
• 第三章 Nrf2在根尖周炎及牙髓血運(yùn)重建過程中表達(dá)的研究40-57
• 1 材料與方法40-49
• 2 結(jié)果49-54
• 3 討論54-57
• 全文總結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 成果65-67
• 縮略詞表67-68
• 致謝68-70

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7 翟，

本文編號(hào)：528452