本文關(guān)鍵詞：TLR4對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響

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【摘要】：第一部分大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)目的：分離大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜組織,培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞,并建立穩(wěn)定的滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。方法：取大鼠顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)的滑膜組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)原代滑膜細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測波形蛋白(vimentin)和CD68的表達(dá)。結(jié)果：倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞外形均勻一致,具有成纖維細(xì)胞的形態(tài),所有培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞均對CD68蛋白表達(dá)陰性,波形蛋白表達(dá)陽性。結(jié)論：采用酶消化法可成功分離培養(yǎng)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞,為后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。第一部分大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)目的：分離大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜組織,培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞,并建立穩(wěn)定的滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。方法：取大鼠顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)的滑膜組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)原代滑膜細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測波形蛋白(vimentin)和CD68的表達(dá)。結(jié)果：倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞外形均勻一致,具有成纖維細(xì)胞的形態(tài),所有培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞均對CD68蛋白表達(dá)陰性,波形蛋白表達(dá)陽性。結(jié)論：采用酶消化法可成功分離培養(yǎng)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞,為后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分TLR4對脂多糖誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響目的：研究Toll樣受體-4(Toll like receptors 4,TLR4)對脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1p、TNF-α的影響,探討TLR4在顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：以終濃度為0,0.1,1,10,100 ng/mL的LPS刺激滑膜成纖維細(xì)胞12h,或以LPS(終濃度100ng/mL)刺激細(xì)胞0,1,6,12,24h,檢測LPS刺激與IL-1β、TNF-α表達(dá)的量效和時效性關(guān)系,選擇最佳的刺激濃度與時間。應(yīng)用LPS刺激細(xì)胞,Western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88的表達(dá)變化,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況,應(yīng)用Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)TLR4、 MyD88、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)變化。用TLR4的特異性抑制劑TAK-242預(yù)處理滑膜成纖維細(xì)胞后,再加入LPS刺激細(xì)胞,應(yīng)用Real-time PCR檢測IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)變化,采用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)LPS刺激后,隨著LPS刺激濃度的增加IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)量逐漸升高。并且,二者與LPS刺激持續(xù)時間呈現(xiàn)一定的時間依賴關(guān)系,IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)量在12h到達(dá)高峰,IL-1β、TNF-αmRNA在6h到達(dá)高峰。LPS能夠明顯增強(qiáng)TLR4、MyD88 mRNA及蛋白表達(dá),TAK-242的應(yīng)用能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)論：TLR4在LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α過程中起到重要的調(diào)控作用,特異性抑制劑TAK-242可以有效地抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1β、 TNF-αmRNA及蛋白的表達(dá)。TLR4可能參與了顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生發(fā)展過程。
【關(guān)鍵詞】：滑膜成纖維細(xì)胞 酶消化法 原代培養(yǎng) IL-1β TNF-α TLR4 滑膜成纖維細(xì)胞 TAK-242
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R782.6
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)13-20
• 1 材料與方法13-17
• 1.1 實驗動物來源13
• 1.2 主要儀器和試劑13-14
• 1.3 實驗方法14-17
• 2 實驗結(jié)果17-18
• 2.1 滑膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察17-18
• 2.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定滑膜成纖維細(xì)胞18
• 2.3 采用MTT法檢測滑膜成纖維細(xì)胞的增殖情況18
• 3 討論18-20
• 4 結(jié)論20
• 第二部分 TLR4對脂多糖誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響20-36
• 1 材料與方法20-27
• 1.1 細(xì)胞來源20
• 1.2 主要儀器和試劑20-21
• 1.3 實驗方法21-27
• 2 實驗結(jié)果27-31
• 2.1 LPS對SFs表達(dá)IL-1β、TNF-α的影響27-29
• 2.2 LPS對SFs表達(dá)TLR4、MyD88的影響29-30
• 2.3 TLR4對LPS誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的影響30-31
• 3 討論31-35
• 4 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-41
• 致謝41-42
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄42-43
• 附件43

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本文編號：517708