本文關鍵詞：IGF-1通過JAK-STAT通路促進牙髓細胞增殖和分化的體外研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過觀察JAK-STAT通路抑制劑AG490對IGF-1調(diào)控人牙髓細胞(human dental pulp cells,HDPCs)增殖、礦化能力及礦化相關基因的影響,探討JAK-STAT通路在IGF-1促牙髓細胞增殖和分化中的作用。方法:牙髓細胞分離培養(yǎng)及來源鑒定:選取因阻生或者正畸減數(shù)拔除的健康恒牙,采用組織塊酶消化法分離、提取牙髓細胞并進行原代培養(yǎng),當細胞增殖并匯合達孔底80%時,用0.25%胰蛋白酶消化并傳代,牙髓細胞傳至3~4代時,選用免疫組化法檢測波形蛋白和角蛋白表達以鑒定細胞來源。IGF-1對人牙髓細胞增殖的影響:以3×103個/孔牙髓細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,細胞培養(yǎng)24h后,換無血清DMEM饑餓細胞24h,然后分別用含2%血清濃度的5、10、25、50和100ng/ml IGF-1刺激液繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)1d、3d、5d和7d,每3天換一次液,每孔加20μl MTT溶液,4h后吸凈培養(yǎng)液,每孔加150μl DMSO溶液,酶標儀以490nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。IGF-1誘導牙髓細胞增殖過程中JAK-STAT通路的作用:以同樣實驗條件將牙髓細胞接種于96孔板中,分5組:①對照組②空白對照組③100ng/ml IGF-1組④50μmol/L AG490+100ng/ml IGF-1組⑤50μmol/L AG490組,培養(yǎng)1d、3d、5d和7d采用MTT法檢測細胞增殖。堿性磷酸酶染色和茜素紅染色分析IGF-1對人牙髓細胞的礦化作用:以2×105個/孔牙髓細胞接種于6孔板中,待牙髓細胞融合至80%時,換成以下4組礦化誘導液①礦化誘導液(Control/M)②100ng/ml IGF-1的礦化誘導液③100ng/ml IGF-1+50μmol/L AG490的礦化誘導液④50μmol/L AG490的礦化誘導液,分別刺激牙髓細胞7d、14d和21d,在室溫下用4%的多聚甲醛固定30min,分別進行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色分析。茜素紅染色后每孔加入1ml10%氯化十六烷基吡啶,測定562nm波長下OD值。RT-PCR檢測成牙/成骨基因m RNA的表達:在上述4組礦化誘導14d的牙髓細胞中加入1ml TRIzol,參考TRIzol說明書提取總RNA。根據(jù)M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)操作說明書反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈c DNA,使用RT-PCR檢測ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA表達。Western blot及免疫熒光法檢測JAK-STAT通路JAK2蛋白磷酸化水平:用含蛋白磷酸酶抑制劑的細胞裂解液RIPA將上述4組礦化誘導4h后的牙髓細胞裂解,提取總蛋白,采用SDS-PAGE凝膠電泳,隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜,牛奶蛋白封閉后,分別孵育p-JAK2(1:1000)與GAPDH(1:1000)一抗及抗兔Ig G二抗(1:20000),最后用雙色紅外激光掃描儀進行掃膜,Image J軟件分析結(jié)果。將處于對數(shù)生長期的牙髓細胞消化,以104個/ml濃度的細胞懸液接種于六孔板中,培養(yǎng)24h后,更換為上述4組礦化誘導液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,用4%多聚甲醛固定細胞30min,隨后用山羊血清封閉30min,再分別孵育兔抗p-JAK2一抗(1:100)與抗兔Ig G二抗(1:1000),最后加入DAPI將細胞核藍染,立刻在免疫熒光顯微鏡下觀察。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析及S-N-K法進行統(tǒng)計學分析,P0.05為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1在體外成功分離和培養(yǎng)出人牙髓細胞,免疫組化法鑒定細胞證實牙髓細胞為中胚層間充質(zhì)細胞來源。2通過MTT法檢測IGF-1不同濃度(5~100ng/ml)對牙髓細胞增殖的影響,結(jié)果為牙髓細胞培養(yǎng)至第5d和7d時,25、50、100ng/ml IGF-1組增殖均高于對照組(P0.05),并隨濃度升高,細胞增殖越多,100ng/ml IGF-1組細胞增殖顯著(P0.01)。本實驗發(fā)現(xiàn)IGF-1+AG490組可以明顯抑制牙髓細胞的增殖作用(P0.01)。3 IGF-1組7d、14d及21d形成的礦化結(jié)節(jié)含量及ALP染色均明顯多于Control/M組,而IGF-1+AG490組礦化結(jié)節(jié)形成量較IGF-1組少,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4 RT-PCR檢測4組礦化誘導液培養(yǎng)14d的人牙髓細胞,發(fā)現(xiàn)IGF-1組中ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA表達升高,且差異顯著(P0.05),IGF-1+AG490組中ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA水平明顯低于IGF-1組(P0.05),與茜素紅及ALP染色結(jié)果一致。5礦化誘導液誘導牙髓細胞4h后,通過Western blot及免疫熒光染色檢測JAK-STAT通路中JAK2蛋白磷酸化水平,結(jié)果顯示IGF-1組磷酸化JAK2(p-JAK2)蛋白表達高于對照組,而IGF-1+AG490組明顯低于IGF-1組(P0.05)。結(jié)論:1采用組織塊酶消化法,在體外成功培養(yǎng)出大量人牙髓細胞,并經(jīng)免疫組化鑒定其來源于中胚間充質(zhì)干細胞,第3~4代牙髓細胞增殖能力強、細胞形態(tài)良好,符合后續(xù)實驗要求。2 25~100ng/ml IGF-1可以促進牙髓細胞的增殖,具有濃度依賴性,100ng/ml IGF-1是促進牙髓細胞增殖和礦化的最佳濃度。3 IGF-1作用于牙髓細胞使JAK2蛋白磷酸化水平升高,IGF-1可能通過JAK-STAT信號通路促進牙髓細胞的增殖和分化,同時可以提高成骨分化蛋白ALP、OCN、OPN和成牙本質(zhì)分化蛋白DSPP基因的m RNA表達。
【關鍵詞】：牙髓細胞 JAK-STAT 胰島素樣生長因子-1 礦化 AG490 牙本質(zhì)涎磷蛋白 骨鈣素
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-26
• 附圖26-34
• 附表34-35
• 討論35-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-43
• 綜述 胰島素樣生長因子-1 對人體多能干細胞生物活性的影響及機制 的研究進展43-52
• 參考文獻47-52
• 致謝52-53
• 個人簡歷53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 劉俊,李玉晶;應用不同方法進行人牙髓細胞原代培養(yǎng)的比較研究[J];北京口腔醫(yī)學;2005年03期

2 謝家敏;田衛(wèi)東;劉磊;;胰島素樣生長因子Ⅰ和堿性成纖維細胞生長因子對人類牙乳頭間充質(zhì)細胞增殖和分化的影響[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年01期

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4 宋靜;何健民;李珊;閆雪萍;盧歡;;牙周膜干細胞成骨分化中細胞因子的作用[J];中國組織工程研究;2013年10期

  本文關鍵詞：IGF-1通過JAK-STAT通路促進牙髓細胞增殖和分化的體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：421809