發(fā)布時(shí)間：2017-05-06 12:06

  本文關(guān)鍵詞：人釉原蛋白及其功能片段LRAP和TRAP的提取和表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:提取人釉原蛋白全長(zhǎng)及其功能片段LRAP和TRAP,并在原核生物內(nèi)表達(dá)和重建。方法:本研究包括以下兩個(gè)部分:實(shí)驗(yàn)一:從處于釉質(zhì)發(fā)育階段的人下頜第三磨牙的牙胚中取得總RNA,通過RT-PCR得到釉原蛋白全長(zhǎng)基因,與pMD19-T載體構(gòu)建質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliTop10中擴(kuò)增,將陽性菌測(cè)序以鑒定為正確的釉原蛋白全長(zhǎng)作模板,重疊延伸PCR構(gòu)建LRAP、擴(kuò)增TRAP基因,克隆后測(cè)序鑒定獲得的LRAP及TRAP。實(shí)驗(yàn)二:釉原蛋白全長(zhǎng)基因及LRAP和TRAP分別與原核表達(dá)載體pET-28a(+)行質(zhì)粒構(gòu)建,將重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選和鑒定后在大腸桿菌E.coli BL21plys中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)蛋白后用變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證。由于LRAP及TRAP基因未表達(dá),另將LRAP及TRAP基因分別與pCold-SUMO原核表達(dá)載體進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建,測(cè)序鑒定后于BL21(DE3)Chaprone宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá),并用rTEV蛋白酶切,Ni-NTA Resin純化,后以SDS-PAGE驗(yàn)證。結(jié)果:對(duì)釉原蛋白基因與pMD19-T載體構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序后比對(duì)分析,結(jié)果與NCBI公布的序列一致,表明獲得了釉原蛋白全長(zhǎng)基因。通過重疊延伸PCR獲得的LRAP片段及擴(kuò)增的TRAP片段經(jīng)克隆并測(cè)序鑒定,結(jié)果與分析片段序列一致,表明獲得了LRAP及TRAP基因。分別將測(cè)序鑒定正確的pET-28a(+)-Am、pET-28a(+)-LRAP和pET-28a(+)-TRAP質(zhì)粒在大腸桿菌E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)并純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢驗(yàn),結(jié)果顯示釉原蛋白在大腸桿菌E.coliBL21plys中誘導(dǎo)表達(dá)了22kDa左右的蛋白,而LRAP及TRAP均未表達(dá)。分別將測(cè)序鑒定正確的pCold-SUMO-LRAP和pCold-SUMO-TRAP在BL21(DE3)Chaprone宿主菌內(nèi)表達(dá)、酶切、純化和SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果示功能片段LRAP及TRAP均在BL21(DE3)Chaprone中誘導(dǎo)表達(dá)了5-6kDa左右的蛋白。結(jié)論:可通過處于釉質(zhì)發(fā)育階段的人下頜第三磨牙牙胚獲得的細(xì)胞總RNA克隆人釉原蛋白及其功能片段LRAP與TRAP。人釉原蛋白全長(zhǎng)及其功能片段LRAP與TRAP均可在原核生物中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。
【關(guān)鍵詞】：釉原蛋白 LRAP TRAP 基因克隆 基因測(cè)序 蛋白表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781
【目錄】：

• 中英文縮略詞表4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 實(shí)驗(yàn)一 人釉原蛋白全長(zhǎng)及其功能片段 LRAP 與 TRAP 的提取、13-31
• 1 材料13-16
• 2 方法16-26
• 3 結(jié)果26-30
• 4 小結(jié)30-31
• 實(shí)驗(yàn)二 釉原蛋白全長(zhǎng)及功能片段 LRAP、TRAP 的原核表達(dá)研究31-49
• 1 材料31-34
• 2 方法34-42
• 3 結(jié)果42-44
• 4 討論44-48
• 5 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 綜述：人釉原蛋白的研究進(jìn)展51-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 致謝63-64
• 作者簡(jiǎn)介64-65

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本文編號(hào)：348355