背景: 腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段相互作用、累積漸進(jìn)的過程,是一系列內(nèi)因和外因共同累積的結(jié)果,其產(chǎn)生的根本原因可以認(rèn)為是基因損害造成的。在細(xì)胞癌變?cè)淼难芯恐姓J(rèn)為:細(xì)胞癌基因的顯性作用是對(duì)細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)機(jī)制,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為通常要有兩個(gè)或兩個(gè)以上癌基因的協(xié)同作用才能發(fā)生正常細(xì)胞的惡變。除了癌基因活化外,尚有抑癌基因的沉默,亦會(huì)引起細(xì)胞的癌變。抑癌基因?qū)?xì)胞增殖起著負(fù)調(diào)控作用,其活性的喪失或降低也是促使正常細(xì)胞發(fā)生惡變的重要機(jī)制。 涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常見的涎腺惡性腫瘤之一。涎腺腺樣囊性癌在小涎腺中發(fā)病率較高,最常見于腭部、腮腺及頜下腺,其次為舌下腺,發(fā)生于舌下腺的惡性腫瘤多為腺樣囊性癌。涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生率無明顯性別差異。兒童期極罕見,多見于40～60歲。腫塊呈圓形或結(jié)節(jié)狀,大小不一。腫塊小者可活動(dòng),輕微疼痛;腫塊大者質(zhì)硬,多數(shù)邊界不清,活動(dòng)性差,有的較固定,與周圍組織相粘連。其生物學(xué)特性為生長(zhǎng)較為緩慢,但侵襲性強(qiáng),常沿神經(jīng)、血管生長(zhǎng),易復(fù)發(fā)和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低。 PTEN基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因位于染色體10q23.3區(qū)有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,長(zhǎng)1212bp,編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白,其產(chǎn)物的相對(duì)分子量為56kDa。其結(jié)構(gòu)包括N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域和C端尾區(qū)。 有研究表明:抑癌基因PTEN與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。PTEN基因主要具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移等功能;還在以下多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,如:胚胎的生長(zhǎng)、發(fā)育,細(xì)胞黏附和遷移,細(xì)胞分化,細(xì)胞衰老與凋亡,維護(hù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定,抑制血管生成等。其作用機(jī)制尚未完全清楚,但目前認(rèn)為主要由以下三條途徑共同完成:①磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinosito1-3,4,5-trisphosphate,PIP3)途徑;②絲裂原激酶(mitogen.activated protein kinase, MAPK)途徑;③局部粘附激酶(focal adhesion kinase , FAK)途徑。 PTEN基因發(fā)生異�？赡苡捎陔s合子丟失、無義突變、某種形式的內(nèi)部剪切異常、錯(cuò)義突變、啟動(dòng)子甲基化等方面的原因造成,從而致使PTEN表達(dá)水平下調(diào)或沉默。目前PTEN基因啟動(dòng)子的甲基化在腫瘤發(fā)生中的作用研究較多,對(duì)正常涎腺組織及涎腺癌組織的研究中發(fā)現(xiàn),抑癌基因PTEN在正常涎腺組織中呈現(xiàn)高表達(dá),在涎腺癌中則為低表達(dá)或失表達(dá)。而在對(duì)肝癌、肺癌、子宮頸癌,乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞等的研究中則證實(shí)了PTEN基因的甲基化水平與PTEN mRNA逆轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)下降或失表達(dá)相關(guān);但PTEN在涎腺腺樣囊性癌中低表達(dá)的機(jī)制是什么?是否與其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)的PTEN基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)相關(guān)? 目的: 本實(shí)驗(yàn)擬研究人正常涎腺細(xì)胞和涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞中抑癌基因PTEN表達(dá)的差異和甲基化狀態(tài)的差異,以及甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′- deoxycytidine, 5-Aza-dc)處理涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞,使PTEN基因去甲基化后對(duì)該細(xì)胞中PTEN基因表達(dá)的影響,從而明確PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化對(duì)涎腺腺樣囊性癌中PTEN基因表達(dá)的影響及其機(jī)制,為臨床涎腺腺樣囊性癌基于PTEN的早期診斷和基于甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療策略的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。 材料與方法: 1、收集正常涎腺組織臨床樣本,對(duì)樣本處理后進(jìn)行原代培養(yǎng),利用細(xì)胞不同的貼壁能力分離出正常的涎腺細(xì)胞,采用HE染色對(duì)正常涎腺進(jìn)行圖像分析,同時(shí)采用MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]比色法觀察不同接種密度對(duì)原代正常涎腺組織細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,通過分析得到最佳的接種密度。 2、按TAKARA試劑說明書提取正常涎腺細(xì)胞和涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACC-2的總RNA,行反轉(zhuǎn)錄PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用Bio-Rad凝膠圖像成像儀觀察結(jié)果,分析PTEN基因在正常涎腺細(xì)胞和涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACC-2中的表達(dá)差異。 3、運(yùn)用設(shè)計(jì)程序“MethPrimer”軟件( http: / /www. urogene. org/methprimer/ )對(duì)位于染色體10q23.3區(qū)的PTEN基因5′側(cè)翼區(qū)的2.1kb序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)CpG島并根據(jù)其序列設(shè)計(jì)甲基化特異性PCR引物;按試劑盒說明書提取正常涎腺細(xì)胞與涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACC-2中的DNA,經(jīng)硫化后行MSP,用Bio-Rad凝膠圖像成像儀觀察結(jié)果,分析正常涎腺細(xì)胞和涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的差異。 4、涎腺腺樣囊性癌(ACC-2)接種于6孔板,24小時(shí)后用10μmol/L甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dc)分別處理24h、48h、72h后提取總RNA,運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá),運(yùn)用Bio-Rad凝膠圖像成像儀分析5-Aza-dc對(duì)PTEN mRNA表達(dá)的影響。 涎腺腺樣囊性癌(ACC-2)接種于6孔板,24小時(shí)后用10μmol/L甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dc)分別處理24h、48h、72h后提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度,運(yùn)用western免疫印跡(Western blotting,WB)檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá),運(yùn)用Bio-Rad凝膠圖像成像儀分析5-Aza-dc對(duì)PTEN蛋白表達(dá)的影響。 5、對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACC-2(購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行培養(yǎng),采用計(jì)數(shù)法和MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)比色法觀察腺樣囊性癌細(xì)胞增長(zhǎng)速率和甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是否對(duì)正常涎腺組織細(xì)胞和涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞生長(zhǎng)有影響。 結(jié)果: 1、正常涎腺細(xì)胞原代培養(yǎng)中可見:多種細(xì)胞成分混合生長(zhǎng),主要由成纖維細(xì)胞和正常涎腺細(xì)胞組成,利用其貼壁能力的不同可將其分離出;采用MTT比色法可見:在一定的接種密度范圍內(nèi),正常涎腺組織細(xì)胞生長(zhǎng)隨接種密度的增加而加快,但隨著時(shí)間的增加,接種密度越高,原代正常涎腺組織細(xì)胞生長(zhǎng)越緩慢,并在后期開始出現(xiàn)原代正常涎腺組織細(xì)胞凋亡,最后得到在0至72小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)不出現(xiàn)原代正常涎腺組織細(xì)胞大量凋亡的最佳接種密度為5×105/孔(以6孔板為標(biāo)準(zhǔn))。 2、PTEN基因在原代正常涎腺組織細(xì)胞和涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中均見表達(dá)。原代正常涎腺組織細(xì)胞的PTEN基因表達(dá)明顯高于涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中PTEN基因的表達(dá)。運(yùn)用Bio-Rad凝膠圖像成像儀對(duì)RT-PCR產(chǎn)物電泳圖片的灰度值進(jìn)行定量分析:原代正常涎腺組織細(xì)胞的PTEN基因表達(dá)明顯高于涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中PTEN基因的表達(dá)。 3、運(yùn)用“MethPrimer”引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)PTEN基因5′側(cè)翼區(qū)的3 kb序列分析,可見該區(qū)段內(nèi)有6個(gè)CpG島;而對(duì)PTEN基因甲基化水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),原代正常涎腺組織細(xì)胞的PTEN基因甲基化水平較涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中PTEN基因甲基化水平低。 4、涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dc)處理后,空白組、24小時(shí)處理組、48小時(shí)處理組、72小時(shí)處理組PTEN基因mRNA均有表達(dá),隨處理時(shí)間的增加,PTEN基因mRNA的表達(dá)會(huì)逐漸增加,運(yùn)用Bio-Rad凝膠圖像成像儀對(duì)RT-PCR產(chǎn)物電泳圖片的灰度值進(jìn)行定量分析:24小時(shí)處理組、48小時(shí)處理組、72小時(shí)處理組的灰度值明顯高于空白組(P0.05);24小時(shí)處理組、48小時(shí)處理組、72小時(shí)處理組三組間的灰度值差別不大(P0.05)。 涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dc)處理后,空白組、24小時(shí)處理組、48小時(shí)處理組、72小時(shí)處理組PTEN蛋白均有表達(dá),隨處理時(shí)間的增加,PTEN蛋白的表達(dá)會(huì)逐漸增加,運(yùn)用Bio-Rad凝膠圖像成像儀對(duì)western免疫印跡圖片進(jìn)行定量分析:24小時(shí)處理組、48小時(shí)處理組、72小時(shí)處理組的灰度值明顯高于空白組(P0.05);24小時(shí)處理組、48小時(shí)處理組、72小時(shí)處理組三組間的灰度值差別不大(P0.05)。 2、在一定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)的生長(zhǎng)速率中顯示細(xì)胞群體倍增時(shí)間約為接種后25.8小時(shí),細(xì)胞群體分裂指數(shù)約在72小時(shí)達(dá)到峰值,用MTT比色法觀察為發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)涎腺腺樣囊性癌的生長(zhǎng)有一定影響。 結(jié)論: 生理狀況下,抑癌基因PTEN在正常組織與細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),而在癌組織與細(xì)胞中則出現(xiàn)低表達(dá)甚至失表達(dá),故PTEN基因可能對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要的作用。當(dāng)PTEN基因出現(xiàn)沉默時(shí),細(xì)胞衰老與凋亡出現(xiàn)異常,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及細(xì)胞周期出現(xiàn)異常,造成腫瘤的發(fā)生。因此PTEN基因的水平可能是腫瘤早期診斷的一個(gè)重要指標(biāo)。同時(shí)在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dc)作用于ACC-2后,PTEN mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)、PTEN蛋白的表達(dá)升高,故PTEN基因在腫瘤中的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化可能存在相關(guān),由于PTEN基因是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制中的重要基因,就為腫瘤早期診斷、預(yù)防、治療提供了新的思路�？梢�,PTEN基因在唾液腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及其甲基化研究對(duì)唾液腺腫瘤的發(fā)生機(jī)制的闡明具有重要的意義,為唾液腺腫瘤的早期診斷和臨床治療中提供新的治療方案提供了一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R739.87
【部分圖文】：
包括N端磷酸酶結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域和C端尾區(qū)[13-16]（如 圖1）。PTEN 蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，它不僅存在于酵母菌等單核生物也存在于哺乳動(dòng)物，只是他們的結(jié)構(gòu)有些差別而已。例如，在單核生物酵母菌中不存在 C2 結(jié)構(gòu)域。PTEN 基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)的主要功能[14,13,42,48]。PTEN 編碼的 403 個(gè)氨基酸序列中含有和酪氨酸磷酸酯酶活性位點(diǎn)相似的HCXXGXXR 核心序列，具有雙特異性磷酸酶活性(DSPs)，能使酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基脫磷酸化。PTEN 中的 HCXXGXXR 核心序列被 N 端磷酸酶結(jié)構(gòu)域的 190 個(gè)氨圖 1：PTEN 基因結(jié)構(gòu)Fig 1：PTEN gene structure相關(guān)博士學(xué)位論文 2011年 第02期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E072-26-10
集中粘附和輔助蛋白的籠形蛋白所包裹的小泡無法脫出；同時(shí)磷酸酶結(jié)構(gòu)域中的PIP2 結(jié)合位點(diǎn)，亦能影響 PTEN 的細(xì)胞膜親和力和磷酸酶活性。C2 結(jié)構(gòu)域能夠與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)磷酸酶結(jié)合，使 C2 結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，從而間接的降低了 PTEN 與細(xì)胞膜的親和力及其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，C2 結(jié)構(gòu)域?qū)TEN 的介導(dǎo)并不依賴 Ca2+，故 C2 結(jié)構(gòu)域和磷酸酶的結(jié)合更加的緊密，因此 C2 結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞膜有效的催化位點(diǎn)。PTEN基因尾部的羧基端有PDZ同源的結(jié)構(gòu)域結(jié)合模體和磷酸化位點(diǎn)，羧基端的結(jié)構(gòu)域能使PTEN與PDZ結(jié)合域蛋白相互作用，形成一種細(xì)胞膜骨架中的典型結(jié)合，而磷酸化位點(diǎn)受到磷酸化后，PTEN蛋白的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，而與胞膜的親和力下降。抑癌基因PTEN在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老與凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、維護(hù)免疫系統(tǒng)的平衡等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[16-19]，目前其作用機(jī)制被廣大學(xué)者認(rèn)同的主要有以下幾條途徑（見圖 2）：
圖 1-1 正常涎腺細(xì)胞，培養(yǎng) 48 小時(shí)（×400）Fig 1-1 Normal salivary gland cells, culturedfor 48 hours (×400)圖 1-2 正常涎腺細(xì)胞，培養(yǎng) 48 小時(shí)（×1000)Fig 1-2 Normal salivary gland cells, culturedfor 48 hours (×1000)圖 1-3 72小時(shí)生長(zhǎng)曲線0.20.30.40.50.6光值（A）吸吸光值
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2892174
