頜面部骨折是口腔頜面外科的常見(jiàn)病和多發(fā)病。隨著我國(guó)交通事故的發(fā)生率逐年遞增,頜面部骨折的發(fā)生率也逐年增加。對(duì)頜面部骨折的診治的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。頜面部骨折同全身其他部位骨折相比,其獨(dú)特性有:復(fù)位和固定時(shí)要求更嚴(yán)格;在復(fù)位固定后,也往往因限制進(jìn)食影響到骨折的愈合;必須在功能恢復(fù)的基礎(chǔ)上滿(mǎn)足患者對(duì)外觀(guān)的要求。因此,頜面部骨折的治療必須要求嚴(yán)格的復(fù)位和固定,并力求骨折盡可能快地愈合。 分子生物學(xué)研究表明,骨折愈合是一個(gè)多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程,其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形成蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2)與骨折愈合密切相關(guān)。bFGF對(duì)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的增殖和分化都有明顯的刺激作用,因而在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BMP-2是骨折修復(fù)時(shí)的啟動(dòng)因子,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞的分化從而促進(jìn)軟骨及骨的形成。 分子創(chuàng)傷學(xué)的發(fā)展使采用外源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子加速骨折愈合成為可能。但目前有關(guān)采用細(xì)胞生長(zhǎng)因子加速頜骨骨折愈合的研究結(jié)果都存在著一定的缺陷,表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)因子一方面生物活性大,生理作用強(qiáng)。另一方面體內(nèi)半衰期短,清除率高,非注射給藥生物利用度低,不能持續(xù)有效的促進(jìn)骨折愈合。為此一些學(xué)者采用骨折局部注射BMP-2和bFGF,或者研制多種緩釋bFGF和BMP-2載體材料等方法試圖解決這一難題,但都存在bFGF和BMP-2降解快,效果短暫,操作復(fù)雜,不能穩(wěn)定而持久地發(fā)揮作用等情況。 納米技術(shù)是一門(mén)在納米級(jí)的尺度下,對(duì)物質(zhì)進(jìn)行制備和工業(yè)化,并相互交叉發(fā)展的綜合性的科技體系。納米微球被器官或組織吸收,能顯著延長(zhǎng)藥效、提高利用度。通過(guò)對(duì)包裹材料的調(diào)控,可以實(shí)現(xiàn)納米微球在體內(nèi)的緩釋和靶向分布。 基于以上分析,結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展,本課題通過(guò)藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn),采用聚乳酸(polylactic acid,PLA)為包裹材料,制備bFGF- PLA納米微球(bFGF-PLA-Ns)、rhBMP-2-PLA納米微球(rhBMP-2-PLA-Ns),探討bFGF和BMP-2緩釋系統(tǒng)加速頜骨骨折愈合的方法。 我們將bFGF-PLA-Ns,rhBMP-2-PLA-Ns膠體液分別制成凍干粉劑和凝膠,研究微球藥物形態(tài)和粒經(jīng)分布;載藥量和包封率;體外緩釋時(shí)間、緩釋方程和生物學(xué)特性等。通過(guò)原代培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞,探討bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。觀(guān)察不同濃度bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響;對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的作用;對(duì)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和對(duì)礦化度的影響;在rhBMP-2-PLA-Ns干預(yù)下,探討成骨細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達(dá)的影響。建立兔下頜骨骨折模型,分別通過(guò)HE染色,免疫組化研究PCNA和Ⅷ因子相關(guān)抗原的變化,四環(huán)素?zé)晒馊旧鹿堑纳?原位雜交研究rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)VEGF的作用等方法,探討bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)兔下頜骨骨折愈合的作用。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果: 1、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的制備和其物理、化學(xué)特性: PLA納米微球制備:Malvern激光粒度分布測(cè)試儀測(cè)定三組PLA膠體平均粒徑分別為161nm,154nm,160nm,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)bFGF和rhBMP-2進(jìn)行精密度、二氯甲烷和丙酮混合物中穩(wěn)定性測(cè)定,證實(shí)bFGF和rhBMP-2精密度和穩(wěn)定性可靠。采用復(fù)乳-干燥法(w/o/w)將bFGF和rhBMP-2制備成bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2- PLA-Ns,通過(guò)電鏡和Malvern激光粒度分布測(cè)試儀測(cè)定,顯示微球的粒莖為30～50nm,該納米微球表面光滑圓整,球體大小均勻,粒徑分布范圍窄。通過(guò)處方優(yōu)化采用1%乳糖作為支架劑,載藥量和包封率研究證實(shí)bFGF-PLA-Ns包封率和載藥量分別為91.72±1.31%和[(27.65±0.44)×10~(-3)]%,rhBMP-2-PLA-Ns包封率和載藥量分別為90.54±1.32%和[(124.73±0.41)×10~(-3)]%。模擬體內(nèi)環(huán)境研究表明,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns在14d內(nèi),不僅一直持續(xù)釋放bFGF和rhBMP-2,而且所釋放出的bFGF和rhBMP-2濃度可以保持在一定的水平。平均濃度分別是bFGF-PLA-Ns為(72.47±6 .26)ng/ml,rhBMP-2-PLA-Ns為(73.44±5.38)ng/ml。以累積釋放率和時(shí)間進(jìn)行擬合,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的體外釋藥規(guī)律均符合Higuichi方程,分別為:Q=27.7636t~(1/2)-13.4247,r=0 9975,Q=26.7687t~(1/2)-12.3283,r=0 9962。 2、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞體外生物學(xué)效應(yīng)研究: 兔成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)并進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察和鑒定。觀(guān)察bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞的增殖效應(yīng)(MTT法)。結(jié)果提示,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns微球均能顯著的增加成骨細(xì)胞的增殖(p0.05)。茜素紅染色研究表明,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns都對(duì)礦化結(jié)節(jié)的形成有顯著的刺激作用(p0.05)。通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的研究,證實(shí)bFGF-PLA-Ns能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化(p0.05)。免疫組化研究bFGF-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)影響,結(jié)果表明bFGF-PLA-Ns能增強(qiáng)PCNA活性(p0.05);免疫熒光研究rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞PCNA表達(dá)影響,表明rhBMP-2-PLA-Ns能增強(qiáng)PCNA活性。Western blot研究rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)成骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響,結(jié)果表明rhBMP-2-PLA-Ns可以刺激成骨細(xì)胞自分泌VEGF的增加。 3、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns促進(jìn)下頜骨骨折愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn):建立兔下頜骨骨折模型,實(shí)驗(yàn)分為5組,設(shè)立空白組,單純bFGF組,bFGF-PLA-Ns凝膠試驗(yàn)組,單純r(jià)hBMP-2組和rhBMP-2-PLA-Ns凝膠試驗(yàn)組。分別在術(shù)后1周,2周,4周,8周處死動(dòng)物。 對(duì)骨折斷段病理切片行HE染色觀(guān)察。結(jié)果提示:與空白組和對(duì)照組相比,試驗(yàn)組術(shù)后1周有新生骨小梁形成;術(shù)后2周有較多編織骨形成,成熟度高;術(shù)后4周編織骨進(jìn)一步增多、成熟、融合,可見(jiàn)大量新生血管和繼發(fā)性骨痂形成,骨痂比例明顯高于空白組和對(duì)照組。 原位雜交檢測(cè)VEGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)證實(shí),rhBMP-2-PLA-Ns實(shí)驗(yàn)組要高于空白組和對(duì)照組(P0.05)。 骨折斷段病理切片PCNA免疫組化研究結(jié)果證實(shí),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、空白組相比,在1、2周PCNA陽(yáng)性細(xì)胞增多(P0.05)。病理切片血管內(nèi)皮細(xì)胞行Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化研究表明,bFGF-PLA-Ns能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的高表達(dá)。 四環(huán)素?zé)晒庾C實(shí)bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns實(shí)驗(yàn)組均可以加快新骨的形成,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、以PLA為載體,采用復(fù)乳-干燥法(w/o/w)制備的bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns達(dá)到納米微球的各項(xiàng)要求,各項(xiàng)組成無(wú)免疫原性,具備良好的生物安全性。 2、實(shí)驗(yàn)采用的微球制備方法和工藝確實(shí)可行。通過(guò)中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本等專(zhuān)利檢索,“堿性成纖維生長(zhǎng)因子聚乳酸緩釋納米微球凝膠及其制備方法”具有原創(chuàng)性,已經(jīng)申請(qǐng)中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局技術(shù)發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?200610095316.9)。 3、體外研究表明bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns對(duì)兔成骨細(xì)胞具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)。 4、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns凝膠能夠促進(jìn)兔下頜骨骨折愈合,表明其在加速骨折愈合上具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類(lèi)】：R782.4
【部分圖文】：

重慶科美納米醫(yī)藥有限公司測(cè)定的PLA膠體粒徑
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王增榮;bFGF-P（HBHO）NPs緩釋微球的制備、性能及生物學(xué)活性檢測(cè)[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2889263