目的：涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居涎腺惡性腫瘤的第二位。嗜神經(jīng)浸潤性和易發(fā)生血行性轉(zhuǎn)移是涎腺腺樣囊性癌的主要特征。其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，因此有必要以調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為靶點(diǎn)研究腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，探索新的治療方法，提高患者的生存質(zhì)量和生存率。Caspase的全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡過程中起至關(guān)重要的作用。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是從十字花科類植物中提取的一種異硫氰酸酯，因其抗腫瘤效果佳而受到廣泛關(guān)注。Caspase家族成員在腫瘤，缺血再灌注，炎癥，組織損傷等過程中參與了多種細(xì)胞的凋亡，Caspase是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。我們近期的研究表明，SFN可以抑制腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。但是在SFN誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡的過程中，Caspase-3,8,9所起的作用，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬對體外培養(yǎng)的人腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞經(jīng)40μM SFN處理后，采用分光光度法檢測Caspase-3,8,9在不同時(shí)間點(diǎn)的活性的變化。并且采用流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理后，SFN誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡情況，從而研究Caspase-3,8,9在SFN誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中的作用，探討其可能的機(jī)制，并為臨床上治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。 材料和方法： 1材料 ACC-M：上海交通大學(xué)口腔頜面外科實(shí)驗(yàn)室提供，建立于1995年；Caspase-3,8,9活性檢測試劑盒及廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK：購自碧云天生物技術(shù)研究所； SFN：購自美國LKT實(shí)驗(yàn)室，純度≥98%；細(xì)胞凋亡試劑盒（Annexin-V-FITC/PI試劑盒）：購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。 2方法 2.1藥液配制 SFN：用DMSO配制成100μM儲(chǔ)存液，-20℃冰箱儲(chǔ)存。使用前用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋。 Caspase抑制劑Z-VAD-FMK的配制：將20μL Caspase抑制劑Z-VAD-FMK（20mM）放入4mL DMSO溶液中，配成100μM儲(chǔ)存液混勻后適當(dāng)分裝備用。 2.2細(xì)胞培養(yǎng)：采用加入10%胎牛血清和青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL）的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)飽和濕度下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞爬滿瓶底壁的80%時(shí)以0.04％EDTA和0.25%胰蛋白酶（1:1）混合液消化傳代。 2.3分光光度法檢測Caspase-3,8,9活性：先利用pNA標(biāo)準(zhǔn)品制作出pNA濃度相當(dāng)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取對數(shù)生長期細(xì)胞制成2.0×105/mL細(xì)胞懸液接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入濃度為40μM的SFN2mL。繼續(xù)培養(yǎng)0h（對照組）、4h、8h、16h和24h，收集細(xì)胞后以PBS洗滌一次，吸盡上清液，按照每20×105個(gè)細(xì)胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解，離心后收集上清，即為待測樣本。分別將10μL待測樣本，80μL檢測緩沖液，10μLAc-DEVD-pNA（或Ac-IETD-pNA或Ac-LEHD-pNA）置于96孔板中，并設(shè)空白對照。將96孔板置于酶標(biāo)儀上測定A405，通過與A405標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA。然后分別繪制以時(shí)間為橫軸，pNA的量為縱軸的Caspase-3,8,9活性圖。 2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測：實(shí)驗(yàn)分三組，先用最終濃度為50μM的Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞2h，再用40μMSFN處理細(xì)胞24小時(shí)作為實(shí)驗(yàn)組（SFN+Caspase抑制劑組）。以0.04%DMSO處理細(xì)胞24小時(shí)作為陰性對照組（DMSO組）。以40μMSFN處理細(xì)胞24小時(shí)作為陽性對照（SFN組）。獲取細(xì)胞后，Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)記活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三遍，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用單因素方差分析對pNA含量和細(xì)胞凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1分光光度法檢測Caspase-3活性：在SFN誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3的活性有明顯升高，在16小時(shí)達(dá)到高峰，之后有所下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各時(shí)間組與空白對照組（0h）相比，均有顯著性差異（0h vs4h:P0.01;0h vs8h: P0.01;0h vs16h: P0.001;0h vs24h: P0.01），各時(shí)間處理組之間比較，4h,8h,24h組之間兩兩比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P0.05。4h,8h,24h組分別與16h組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P0.05。 2分光光度法檢測Caspase-8活性：在SFN誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-8的活性有明顯升高，在16小時(shí)達(dá)到高峰，之后有所下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各時(shí)間組與空白對照組（0h）相比，均有顯著性差異（0h vs4h:P0.05;0h vs8h: P0.01;0h vs16h: P0.001;0h vs24h: P0.01），各時(shí)間處理組之間比較，4h,8h,24h組之間兩兩比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P0.05。4h,8h,24h組分別與16h組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P0.001。 3分光光度法檢測Caspase-9活性：在SFN誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-9的活性有明顯升高，在16小時(shí)達(dá)到高峰，之后有所下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各時(shí)間組與空白對照組（0h）相比，均有顯著性差異（0h vs4h:P0.05;0h vs8h: P0.001;0h vs16h: P0.001;0h vs24h: P0.001），各時(shí)間處理組之間兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（4h vs8h: P0.001;4h vs16h:P0.001;4h vs24h: P0.001;8h vs16h: P0.001;8h vs24h: P0.001;16hvs24h: P0.05）。 4流式細(xì)胞術(shù)檢測法：SFN組細(xì)胞凋亡明顯，DMSO組和SFN+Caspase抑制劑組也有細(xì)胞凋亡，但凋亡率低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SFN組與SFN+Caspase抑制劑組相比，凋亡率有顯著差異（P0.01）。DMSO組與SFN+Caspase抑制劑組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05﹚。 結(jié)論： 1SFN誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌ACC-M凋亡過程中，Caspase-3,8,9的活性均在4小時(shí)時(shí)即出現(xiàn)增高，并持續(xù)到24小時(shí)，且在16小時(shí)時(shí)活性最高。 250μMCaspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞2h，能顯著抑制SFN誘導(dǎo)的ACC-M細(xì)胞凋亡，證明Caspase家族成員在SFN誘導(dǎo)的ACC-M細(xì)胞凋亡中起作用。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R739.8
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料與方法
結(jié)果
附圖
附表
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2884108