本文關(guān)鍵詞：變異鏈球菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中ptxA基因功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的變異鏈球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)是引起人類齲齒的主要致齲菌之一,它的高致齲能力與其產(chǎn)酸、耐酸、黏附等特性密切相關(guān)。2002年,S. mutans UA159全基因組測(cè)序工作完成,研究表明,該菌中與碳水化合物代謝相關(guān)的基因占了15%,與現(xiàn)有其它已測(cè)序的革蘭氏陽(yáng)性菌基因組對(duì)比,S. mutans呈現(xiàn)出更強(qiáng)的碳水化合物代謝能力。S. mutans轉(zhuǎn)運(yùn)吸收碳水化合物主要是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate-dependent:phosphotransferase system, PTS)完成的。目前在S. mutans UA59中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)14種PTS,包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、甘露糖等。PTS一般由酶Ⅰ、HPr和酶Ⅱ復(fù)合體三部分組成。其中酶Ⅰ、HPr不具有糖特異性,負(fù)責(zé)將磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)轉(zhuǎn)移至酶Ⅱ復(fù)合體。酶Ⅱ復(fù)合體則具有糖特異性,負(fù)責(zé)對(duì)特定底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及磷酸化,一般由三個(gè)蛋白組成：ⅡA、ⅡB和ⅡC。雖然S. mutans可以通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體或其他方式吸收利用碳水化合物,但最主要的方式依然是通過(guò)PTS,因此研究S. mutans PTS中相關(guān)蛋白對(duì)理解該菌的致齲作用有重要意義。研究報(bào)道,某些腸道細(xì)菌,如大腸桿菌(Escherichia Coli, E.coli)、乳酸桿菌(Lactobacillus)等在無(wú)氧條件下能通過(guò)發(fā)酵抗壞血酸來(lái)獲得維持生命活動(dòng)的碳源,但目前未見(jiàn)關(guān)于S. mutans對(duì)抗壞血酸吸收利用的報(bào)道。2009年,雷劍推測(cè)PtxA蛋白(由ptxA基因編碼)可能與S. mutans抗壞血酸代謝過(guò)程相關(guān),對(duì)應(yīng)PTS中的EⅡA,對(duì)該蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)解析和體外酶活實(shí)驗(yàn)也證明PtxA蛋白對(duì)抗壞血酸磷酸化具有特異性。因此,在S. mutans內(nèi)存在能吸收并磷酸化抗壞血酸的PtxA蛋白可能對(duì)該菌能在接近無(wú)氧的口腔環(huán)境中旺盛生長(zhǎng)具有關(guān)鍵性作用。因此本研究擬針對(duì)PtxA蛋白,通過(guò)構(gòu)建ptxA基因突變菌株,對(duì)其生長(zhǎng)活性、產(chǎn)酸能力、耐酸能力、生物膜形成能力等致齲性進(jìn)行研究,探討其致齲機(jī)制,為防齲研究開(kāi)辟新思路。第一章 變異鏈球菌ptxA基因突變菌株的構(gòu)建目的：構(gòu)建S. mutans UA159 ptxA基因突變菌株,為下一步的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。方法：根據(jù)NCBI提供的S. mutans UA159全基因組序列,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ptxA基因的上下游引物,通過(guò)PCR方式擴(kuò)增上下游片段,然后通過(guò)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選鑒定等方法構(gòu)建含有ptxA基因上游片段的重組質(zhì)粒pFW5-ptxA-up,接著在此重組質(zhì)�；A(chǔ)上,再用相同的方法構(gòu)建含有ptxA基因下游片段的重組質(zhì)粒pFW5-ptxA-up-down,最后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入S. mutans感受態(tài)細(xì)胞中,利用同源重組原理構(gòu)建ptxA基因突變菌株,命名為SM-ptxA-def。結(jié)果：1、重組質(zhì)粒pFW5-ptxA-up經(jīng)過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后,電泳結(jié)果出現(xiàn)2條帶,與質(zhì)粒pFW5和ptxA-up片段的大小基本相同,重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示99%相符。2、重組質(zhì)粒pFW5-ptxA-up-down經(jīng)過(guò)NcoⅠ和Nde Ⅰ雙酶切后,電泳結(jié)果出現(xiàn)2條帶,與質(zhì)粒pFW5-ptxA-up和ptxA-down片段的大小基本相同,重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示99%相符。3、使用相同的ptxA-up-F和ptxA-down-R引物進(jìn)行擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示SM-ptxA-def菌株的擴(kuò)增片段大小與重組質(zhì)粒pFW5-ptxA-up-down一致,比野生型片段大,與預(yù)計(jì)相符。SM-ptxA-def菌株的擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果顯示100%相符。第二章野生型變異鏈球菌在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況目的：探究適合野生型S. mutans UA159在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最適濃度,并進(jìn)一步驗(yàn)證ptxA基因與抗壞血酸的吸收利用有關(guān),為研究SM-ptxA-def菌株生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。方法：1、最適抗壞血酸濃度探究。將S. mutans UA159在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h后,用TV培養(yǎng)基(含有3.5%胰蛋白胨、0.04μg/mL對(duì)氨基苯甲酸,0.2μg/mL鹽酸硫胺酸,1μg/mL煙酰胺和0.2μg/mL核黃素)洗滌,調(diào)節(jié)OD600=1.0左右,按1：100比例加入到含有5mM、10mM、15mM、20mM、30 mM抗壞血酸濃度的TV培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)48h,每2h取2mL菌液測(cè)量OD600值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次,取均值,繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。2、S. mutans UA159在兩種不同碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況。將S. mutans UA159在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h后,用TV培養(yǎng)基洗滌,調(diào)節(jié)OD600=1.0左右,按1：100比例分別加入到含有15mM抗壞血酸和葡萄糖的TV培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)48h,每2h取2mL菌液測(cè)量OD600值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次,取均值,繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。3、qRT-PCR檢測(cè)ptxA基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中的表達(dá)。將S. mutansUA159在15mM抗壞血酸和葡萄糖的TV培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以16S rRNA為內(nèi)參,進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),檢測(cè)ptxA基因在兩種不同碳源特異性培養(yǎng)基中的表達(dá)。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果：1、在測(cè)量的48h內(nèi),菌液的OD600值隨時(shí)間的增加而增加,表明細(xì)菌不斷生長(zhǎng)。在5mM和10mM時(shí),細(xì)菌的停滯期(約為6h)和在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度類似,但10mM的終末細(xì)菌產(chǎn)量高于5mM。在15mM時(shí),停滯期延長(zhǎng)(約為12h),但終末細(xì)菌產(chǎn)量比10mM高。在20mM和30mM時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)速度非常緩慢,終末細(xì)菌產(chǎn)量大大低于15mM,30mM時(shí)未觀察到明顯增長(zhǎng)。2、S. mutans UA159在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速,停滯期短,生長(zhǎng)速度快,約14-16h即達(dá)到穩(wěn)定期,終末菌量OD600達(dá)到1.0左右。而在以抗壞血酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中則生長(zhǎng)緩慢,停滯期延長(zhǎng),生長(zhǎng)速度也較慢,約36h才達(dá)到穩(wěn)定期,終末菌量OD600僅為0.6左右。3、ptxA基因在以抗壞血酸為唯一碳源培養(yǎng)基中的表達(dá)量明顯高于在以葡萄糖為唯一碳源培養(yǎng)基的表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1、S. mutans UA159在15mM抗壞血酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳,因此確定其為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)濃度。2、ptxA基因與S. mutans UA159在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相關(guān)。第三章SM-ptxA-def菌株生物學(xué)特性的初步研究目的：研究ptxA基因突變后對(duì)S. mutans UA159的生長(zhǎng)活性、產(chǎn)酸能力、耐酸能力、生物膜形成能力等生物學(xué)特性的影響。方法：1、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株生長(zhǎng)活性比較。將兩種細(xì)菌在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h后,調(diào)節(jié)菌液OD600約為相等,然后按1：20比例加入到含有15 mM抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中,混勻后置于37℃厭氧系統(tǒng)中培養(yǎng)48h,每2h取2mL菌液測(cè)量OD600值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。2、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株產(chǎn)酸能力比較。將兩種細(xì)菌在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h后,調(diào)節(jié)菌液OD600約為相等,然后按1：20比例均加入含有15 mM抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中,混勻后置于37℃厭氧系統(tǒng)中培養(yǎng)48h,測(cè)量培養(yǎng)前后菌液pH值,得到兩種菌株培養(yǎng)前后的△pH。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。3、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株耐酸能力比較。將兩種細(xì)菌在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h后,調(diào)節(jié)菌液OD600約為相等,然后按1：20比例加入到含有15 mM抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中,混勻后置于37℃厭氧系統(tǒng)中培養(yǎng)OD600≈0.3,取1mL菌液,用pH 7.0的甘氨酸溶液洗滌2次,重懸,再將其置入pH 2.8的甘氨酸溶液中0,15,30,45min,稀釋,涂板,厭氧培養(yǎng)48h后計(jì)算菌落總數(shù),細(xì)菌活力以生存率(N/N0)表示：處理后菌落數(shù)(N)/處理前菌落數(shù)(No)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。4、野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株生物膜形成能力比較。將兩種細(xì)菌在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h后,調(diào)節(jié)菌液OD600約為相等,然后按1：20比例均加入到含有15mM抗壞血酸的TV培養(yǎng)基中,混勻后置于37℃C厭氧系統(tǒng)中培養(yǎng)至菌液混濁,調(diào)整OD600=1,按1：40比例接種到96孔酶標(biāo)板中,每組各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每孔150μL,厭氧培養(yǎng)24h后使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量OD595,丟棄懸浮菌液,滅菌水漂洗1次,瀝干,加入30μL0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min,棄去染色液,滅菌水漂洗3次,室溫干燥后,加入4：1的乙醇：丙酮混合液,使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量OD570,計(jì)算生物膜量比值：OD570/OD595。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株的產(chǎn)酸、耐酸和生物膜形成能力均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：1、與野生型相比,SM-ptxA-def菌株的停滯期更長(zhǎng),生長(zhǎng)速度略慢,終末菌量更低。2、在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)48后,野生型S. mutans UA159的培養(yǎng)基中△pH值明顯高于SM-ptxA-def菌株(P0.05)。3、在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的野生型S. mutans UA159和SM-ptxA-def菌株在pH2.8的甘氨酸緩沖液中孵育長(zhǎng)達(dá)45min后,死亡速率類似,無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4、在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,野生型S. mutansUA159的生物膜形成量顯著高于SM-ptxA-def菌株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1、ptxA基因缺失對(duì)S. mutans在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)有一定影響。2、ptxA基因可能與S. mutans在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力有關(guān)。3、ptxA基因與細(xì)菌的耐酸能力無(wú)明顯關(guān)系。4、ptxA基因可能與S. mutans在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生物膜形成有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：變異鏈球菌UA159 ptxA基因 基因敲除 抗壞血酸 生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.1;Q936;Q78
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-23
• 第一章 變異鏈球菌ptxA基因突變菌株的構(gòu)建23-45
• 1 材料和方法23-36
• 2 結(jié)果36-42
• 3 討論42-45
• 第二章 野生型變異鏈球菌在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況45-54
• 1 材料和方法45-50
• 2 結(jié)果50-52
• 3 討論52-54
• 第三章 SM-ptxA-def菌株生物學(xué)特性的初步研究54-61
• 1 材料和方法54-56
• 2 結(jié)果56-58
• 3 討論58-61
• 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 中英文對(duì)照縮略詞表69-70
• 成果70-72
• 致謝72-73

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：變異鏈球菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中ptxA基因功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：278278