本文關(guān)鍵詞：HEMA對人牙髓細胞、成牙本質(zhì)樣細胞中MMPs表達的影響與調(diào)控，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學(xué)》 2015年

STAT3在CTGF調(diào)控人牙髓細胞分化中作用的研究

劉從娜  

【摘要】：炎癥、外傷等造成的牙髓損傷逐年增多,而現(xiàn)有的臨床治療方法還不能完全再造牙髓或代替牙髓組織的功能。牙髓細胞(Human Dental Plup Cells,h DPCs)是一種具有一定的自我增殖和分化潛力的細胞。以往研究已證實體外培養(yǎng)的牙髓細胞有形成鈣化組織的能力,這種能力依賴于有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子的調(diào)控,即細胞因子能夠不同程度的刺激受損的牙髓細胞再生。結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)具有強烈促纖維化的作用,它可以增強牙髓細胞的礦化能力,但不能刺激牙髓細胞增殖,其中作用的分子機制尚不清楚。近年來發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus protein tyrosine kinase-Signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路與炎癥反應(yīng)、細胞增殖、分化等相關(guān)。本研究即探討STAT3是否在CTGF刺激牙髓細胞增殖分化過程中起重要作用。第一部分CTGF在人牙髓細胞增殖、分化過程中的作用目的:體外培養(yǎng)h DPCs,觀察CTGF對h DPCs增殖、分化的影響。方法:選取由于正畸或阻生拔除的健康、完整的第三磨牙(均經(jīng)患者知情同意),在無菌條件下取出牙髓組織,采用組織酶消化法原代培養(yǎng)h DPCs并鑒定來源。采用不同濃度(0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的CTGF作用于h DPCs,作用不同時間后,通過甲基噻唑基四唑(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)檢測CTGF對h DPCs增殖的影響;茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。結(jié)果:1組織塊酶解法能成功培養(yǎng)出成纖維樣細胞,倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)均一,為典型的梭形,胞體豐滿,胞漿豐富,細胞核呈圓形或卵圓形位于細胞中央,核仁清晰可見。免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果示波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性。2 MTT結(jié)果顯示CTGF三個濃度(10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)均對細胞無毒性作用,能促進h DPCs增殖,且隨著時間延長作用效果增強,第1天,實驗組與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),從第3天開始,實驗組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);茜素紅結(jié)果顯示CTGF組的礦化結(jié)節(jié)明顯高于對照組。結(jié)論組織塊酶解法能成功分離和培養(yǎng)出h DPCs;一定濃度的CTGF能夠促進牙髓細胞增殖和分化。第二部分CTGF對人牙髓細胞中STAT3蛋白表達的影響目的:觀察CTGF作用h DPCs后,細胞中STAT3蛋白的表達情況。方法:取第四代h DPCs制成細胞懸液,爬片后隨機分為對照組、CTGF處理組、Stattic(STAT3特異性抑制劑)+CTGF處理組,分別培養(yǎng)30min后采用免疫組化SABC法檢測中STAT3活性蛋白(磷酸化蛋白,Phos-STAT3)的表達情況。結(jié)果:h DPCs培養(yǎng)30 min后,CTGF處理組可見棕色顆粒主要分布在細胞核中,即Phos-STAT3主要在細胞核中表達;對照組相反,棕色顆粒主要分布在細胞質(zhì)中,Phos-STAT3在胞質(zhì)中表達,細胞核中無表達;Stattic+CTGF處理組細胞質(zhì)中棕色顆粒比對照組明顯減少,細胞核中無棕色顆粒,Phos-STAT3在細胞質(zhì)中表達,但表達量比對照組降低。結(jié)論:CTGF能明顯促進STAT3磷酸蛋白的表達,并誘導(dǎo)Phos-STAT3轉(zhuǎn)移細胞核中表達;Stattic能抑制STAT3蛋白磷酸化。第三部分STAT3在CTGF誘導(dǎo)牙髓細胞分化中的作用目的:Stattic與CTGF聯(lián)合作用h DPCs后,觀察礦化結(jié)節(jié)以及ALP、OCN、OPN和DMP-1 m RNA表達水平。方法:取第4代人牙髓細胞制成細胞懸液,以104個/ml的濃度接種在6孔板和50 ml培養(yǎng)瓶中,細胞匯合后,將h DPCs隨機分為空白對照組、陽性對照組(20ng/ml的CTGF)和實驗組(STAT3抑制劑Stattic作用半小時后加入20ng/ml的CTGF),作用7 d、14 d、28 d后,采用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成,Real-time PCR法檢ALP、OCN、OPN和DMP-1的m RNA表達水平。結(jié)果:茜素紅結(jié)果:與陽性對照組相比,加入Stattic后,礦化結(jié)節(jié)形成明顯減少。PCR結(jié)果顯示:7天時,加入Stattic后,ALP、OCN、OPN和DMP-1的m RNA表達下降,CTGF組表達增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);14天時,加入Stattic后,ALP m RNA表達下降,CTGF組表達增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Stattic組與對照組OCN m RNA表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),CTGF組的OCN m RNA表達增高,與其他兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Stattic組與對照組OPN m RNA表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),CTGF組的OPN m RNA表達降低,較其他兩組有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);DMP-1m RNA表達各組比對照組表達都降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:STAT3在CTGF誘導(dǎo)牙髓細胞分化中起重要作用。綜上所述,CTGF能促進h DPCs增殖和分化,并且能夠激活STAT3通路,使h DPCS中STAT3磷酸化蛋白表達增高,并促進Phos-STAT3轉(zhuǎn)移到細胞核中。這一研究為揭示CTGF促進h DPCs分化的機制以及為臨床開展新的牙髓炎癥治療方案提供了實驗依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.3
【目錄】：

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