【摘要】：牙髓干細胞(Dental Pulp Stem Cells DPSCs)這一概念最早是由Shi S和Gronthos S在2000年提出，其與成骨細胞類似為間充質(zhì)細胞來源，被認為是成熟牙髓組織的前體，在生理或病理狀態(tài)下能夠分化為成牙本質(zhì)細胞，進而形成修復(fù)性牙本質(zhì)。同大多數(shù)干細胞一樣，牙髓干細胞在體外培養(yǎng)的過程中也會發(fā)生自分化，逐漸失去自我更新的能力。因此作為牙組織工程中種子細胞的重要來源，使得其在體外培養(yǎng)的過程中保持干性避免自分化是亟待解決的問題。 Notch信號通路調(diào)控著細胞間的分化、增殖和凋亡。其最基本也是最重要的作用體現(xiàn)在其介導(dǎo)的側(cè)抑制作用使細胞分化相關(guān)的特異性基因表達受阻，從而使得細胞處于較原始的未分化狀態(tài)。因此有學(xué)者提出利用Notch通路的“分化抑制作用”使得干細胞在體外培養(yǎng)的過程中保持自我更新能力。利用這一理念，通過在造血干細胞中過表達Notch受體，使得造血干細胞在體外培養(yǎng)成功獲得了“永生”。 相鄰細胞間位于胞膜上的Notch配體和受體結(jié)合，從而暴露出Notch1的胞內(nèi)段NICD（Notch intracellular domain），活化的NICD轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)將激活Notch通路的靶基因，從而激活Notch信號。已有學(xué)者證實外源性NICD能夠激活細胞內(nèi)Notch通路下游的基因，其對靶基因的調(diào)控與Notch配體和受體結(jié)合后所誘導(dǎo)的Notch信號激活途徑一致。因此在細胞內(nèi)過表達NICD，來模擬Notch途徑上調(diào)的過程被廣泛應(yīng)用于Notch通路的研究中。本實驗旨在通過慢病毒載體介導(dǎo)的NICD轉(zhuǎn)染人的DPSCs，上調(diào)DPSCs中NICD的表達，探究其對DPSCs增殖和分化的影響，并初步探討Notch通路對DPSCs增殖和分化的作用機制。 目的：構(gòu)建穩(wěn)定過表達NICD的牙髓干細胞；觀察過表達NICD對牙髓干細胞增殖分化的影響；初步研究Notch通路對DPSCs增殖和分化的作用機制。 方法： 1.穩(wěn)定過表達NICD的牙髓干細胞的建立：復(fù)蘇前期實驗組的原代人牙髓干細胞，鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞活性良好；轉(zhuǎn)染外源性的過表達NICD的慢病毒載體，使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達的細胞株，western blot技術(shù)和RT-PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染后NICD表達水平上升，細胞免疫熒光技術(shù)觀察NICD表達量及其表達位置的改變。實驗分為DPSCs/NICD組、DPSCs/vector組、DPSCs/wt組。 2.觀察過表達NICD后對牙髓干細胞增殖、遷移和分化的影響：通過CCK-8法和流式細胞技術(shù)檢測S期的改變，觀察外源性NICD對牙髓干細胞增殖的影響；誘導(dǎo)細胞分化并通過western blot技術(shù)檢測牙髓干細胞分化的特異性蛋白DSPP的表達；Transwell檢測三組細胞遷移能力的強弱。實驗分組同上。 3.過表達NICD對DPSCs增殖和分化的作用機制研究：western blot技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)觀察Hes1、Runx2的表達改變，實驗分為DPSCs/NICD組、DPSCs/vector組。通過siRNA-Hes1，觀察抑制Hes1表達后，Runx2和DSPP的表達變化，探討Notch通路調(diào)節(jié)DPSCs增殖和分化的作用機制。實驗分組：DPSCs/vector組、DPSCs/NICD組、DPSCs/vector/siRNA-Hes1和DPSCs/NICD/siRNA-Hes1。 結(jié)果： 1.成功建立穩(wěn)定過表達NICD的牙髓干細胞，NICD在DPSCs/NICD組的表達明顯高于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組，并且加速其核內(nèi)表達，而后兩者之間的表達沒有顯著差異。 2.相對于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組，DPSCs/NICD組的增殖能力明顯增強，S期比例上升，DSPP表達顯著下調(diào)，細胞遷移能力明顯增強，而前兩組之間未見明顯差異。 3.過表達NICD后，DPSCs/NICD組的Hes1表達明顯上調(diào)，Runx2的表達明顯下調(diào)，與DPSCs/vector組相比較均有顯著性差異。siRNA-Hes1后，與對照組相比較，各組Hes1的mRNA和蛋白表達均有不同程度的下調(diào)，，其中，DPSCs/vector/siRNA-Hes1組表達下調(diào)最為顯著，與DPSCs/NICD組相比有顯著性差異；siRNA-Hes1后，Runx2和DSPP的mRNA和蛋白表達均稱上升趨勢，各組與對照組相比較均有顯著性差異，其中，與DPSCs/vector組相比較，DPSCs/vector/siRNA-Hes1組的Runx2和DSPP表達上調(diào)最為明顯。結(jié)果顯示，Runx2與DSPP表達呈正相關(guān)。 結(jié)論： 1.轉(zhuǎn)染過表達NICD的慢病毒顆粒后，NICD可在體外培養(yǎng)的DPSCs中呈穩(wěn)定性的高表達。 2.過表達的NICD促進牙髓干細胞的增殖和遷移，抑制了牙髓干細胞的成牙本質(zhì)分化。 3.過表達NICD后，促進DPSCs中Notch通路靶基因Hes1的表達并抑制Runx2的活性，從而抑制DSPP的表達以及DPSCs的分化；抑制Hes1的活性上調(diào)Runx2和DSPP的表達，促進DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R781.3

【參考文獻】

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1 郭紅延,吳補領(lǐng),郭希民,楊成,徐蓬,王常勇;重建牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

本文編號：2396738