本文關(guān)鍵詞：牙齦卟啉單胞菌HA2、fimA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《遵義醫(yī)學院》 2016年

牙齦卟啉單胞菌HA2、fimA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達的研究

苗晨琛  

【摘要】：目的:以牙齦卟啉單胞菌牙齦素-血凝素基因編碼區(qū)的核心功能區(qū)HA2和菌毛蛋白基因fim A為目的基因,以SD大鼠IL-15基因為免疫佐劑,構(gòu)建穩(wěn)定高效的真核表達質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15和p VAX1-HA2,體外實驗觀察目的基因HA2、fim A和佐劑基因IL-15 m RNA水平的表達及免疫佐劑IL-15蛋白的表達,為下一步實驗提供實驗基礎(chǔ)和物質(zhì)條件。方法:本實驗共分為三部分:第一部分:真核表達質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15、p VAX1-HA2的構(gòu)建1.牙齦卟啉單胞菌的總DNA的提取、SD大鼠的總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄,獲得目的基因HA2、fim A、IL-15基因及IRES序列,二次拼接將基因串聯(lián)獲得HA2-fim A/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fim A、fim A/IL-15、HA2片段,同時插入酶切位點Xho I、Nhe I。2.目的片段HA2-fim A/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fim A、fim A/IL-15、HA2以及載體p VAX1的Xho I、Nhe I雙酶切。3.將p VAX1片段與目的片段HA2-fim A/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fim A、fim A/IL-15、HA2進行拼接獲得陽性克隆,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,同時進行測序鑒定。第二部分:重組質(zhì)粒在真核細胞中m RNA水平的檢測1.人源腎上皮細胞293T細胞的培養(yǎng)2.重組質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15、p VAX1-HA2轉(zhuǎn)染293T細胞,同時設(shè)計空白對照組,轉(zhuǎn)染24h后提取293T細胞的總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄。3.分別根據(jù)目的基因的序列設(shè)計特異性引物,PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳驗證其大小,擴增產(chǎn)物同時進行測序,結(jié)果進行BLAST比對。第三部分:重組質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-fim A/IL-15在真核細胞中IL-15蛋白表達水平的檢測1.293T細胞的培養(yǎng)及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞2.ELISA定量檢測IL-15表達量(1)293T細胞總蛋白及上清蛋白的收集(2)IL-15蛋白標準曲線的繪制及待測蛋白的檢測,并對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果:1.重組質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15和p VAX1-HA2經(jīng)酶切及測序鑒定,目的基因HA2、fim A及IL-15定向插入至真核表達質(zhì)粒p VAX1,中間連接IRES序列與設(shè)計一致,插入位置正確,目的基因讀碼框未發(fā)生改變。2.五個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞,RT-PCR擴增目的基因HA2、fim A、IL-15,可見單一目的條帶,大小與預(yù)計相同,測序結(jié)果與NCBI進行BLAST比對,與已公布的基因序列相同。3.繪制出IL-15的標準曲線,并檢測出IL-15表達量,結(jié)果表明p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-fim A/IL-15與p VAX1陰性對照組及空白對照組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(p﹤0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15、p VAX1-HA2,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核細胞293T細胞后,RT-PCR證實目的基因在m RNA水平能夠被正確表達,ELISA證實重組質(zhì)粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15和p VAX1-fim A/IL-15中IL-15在蛋白水平能夠表達。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R780.2
【目錄】：

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