本文關(guān)鍵詞：靜壓力作用下經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控牙周膜干細胞骨向分化的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第四軍醫(yī)大學》 2015年

靜壓力作用下經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控牙周膜干細胞骨向分化的機制研究

馬小杰  

【摘要】：正畸牙移動(orthodontic tooth movement,OTM)涉及了復雜的生物學行為,主要包括兩個層面的內(nèi)容:生物力學和生物學,前者是指機械刺激作用于牙齒,產(chǎn)生張應力和壓應力,而后者是指牙齒感受應力,并將其傳遞至牙周組織,從而引發(fā)了一系列復雜的細胞生物學反應,二者相互關(guān)聯(lián),協(xié)同作用。有研究證實,在OTM過程中,張力側(cè)成骨活躍,主要表現(xiàn)為以骨沉積為主的骨塑建;而壓力側(cè)成骨/破骨動態(tài)平衡,以骨吸收為主。了解更多更新的OTM發(fā)生發(fā)展的生物學基礎(chǔ),將有助于我們更加安全有效的開展臨床工作。眾所周知,在OTM過程中,牙周組織感受機械應力,并產(chǎn)生生物學效應,是保證牙齒移動的關(guān)鍵因素。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)存在于牙周組織,可自我更新,并分化為成骨細胞等成熟細胞。有文獻報道稱,PDLSCs參與維持牙周膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),在牙槽骨改建中發(fā)揮了一定的作用,推測其在OTM過程中扮演了重要的角色。隨后,有學者利用大鼠OTM模型證實,隨著加力時間的延長,不僅張力側(cè)牙周膜內(nèi)PDLSCs的數(shù)目逐漸增多,而且壓力側(cè)PDLSCs亦呈上升趨勢,提示其參與了OTM。而體外細胞力學加載實驗雖已發(fā)現(xiàn),在牽張力等機械刺激的作用下,PDLSCs的增殖和分化等生物學特性會發(fā)生明顯改變,但關(guān)于壓應力對其生物學行為影響的研究很少且機制不清。但目前已有研究證實,Wnt信號通路廣泛存在于生物體內(nèi),參與調(diào)節(jié)骨源性細胞對機械刺激的適應性反應,在骨的形成和改建中發(fā)揮了重要的作用。因此本課題首先建立大鼠OTM模型,通過檢測PDLSCs在大鼠牙周膜內(nèi)的表達,為其參與OTM提供了新的證詞;隨后使用可控液壓加載裝置,模擬體內(nèi)PDLSCs的受壓環(huán)境,通過檢測體外培養(yǎng)的PDLSCs受壓后成骨分化相關(guān)指標的表達變化,探討OTM過程中壓力對PDLSCs骨向分化能力的影響;最后,本實驗還通過檢測壓力作用下經(jīng)典Wnt信號通路對PDLSCs骨向分化能力的調(diào)控,為OTM過程中細胞生物學反應及其發(fā)生機制提供了理論和實驗基礎(chǔ)。第一部分大鼠OTM模型的研究研究目的構(gòu)建大鼠OTM模型,檢測PDLSCs在大鼠牙周膜內(nèi)的表達,證實PDLSCs參與了OTM。研究方法按隨機原則,將大鼠分為4組,包括對照組和實驗1、3、7d組,每組6只,其中空白對照組不施加任何壓力裝置,而正畸加力組則以上頜切牙為支抗,用螺旋鎳鈦拉簧拉大鼠右上頜第一磨牙近移。加力完成后取材,HE染色觀察牙周組織形態(tài)學變化。TRAP染色檢測壓力側(cè)牙周膜內(nèi)破骨細胞的數(shù)目變化。免疫組化染色觀察干細胞標記nestin和PDGFRα的表達。研究結(jié)果(1)HE染色結(jié)果顯示,牙周組織形態(tài)學變化具有時間依賴性,表現(xiàn)為與對照組相比,隨著加力時間的增長,壓力側(cè)牙周膜間隙逐漸縮小,牙槽骨吸收越來越嚴重。(2)TRAP染色結(jié)果顯示,大鼠壓力側(cè)牙周膜內(nèi)靠近牙槽骨吸收凹陷處可見破骨細胞。(3)免疫組化染色結(jié)果顯示,與對照組相比,隨著加力時間的延長,大鼠壓力側(cè)牙周膜內(nèi)nestin與PDGFRα的表達呈上升趨勢。結(jié)論PDLSCs在大鼠牙周膜內(nèi)的數(shù)目增多及分布更廣,表明其參與了OTM。第二部分壓力對h PDLSCs成骨分化能力的影響研究目的使用可控液壓加載裝置,模擬體內(nèi)h PDLSCs的受壓環(huán)境,檢測受壓后h PDLSCs的成骨相關(guān)指標的表達變化,探討壓力對h PDLSCs骨向分化能力的影響。研究方法(1)體外分離培養(yǎng)h PDLSCs,對其干性和分化能力進行鑒定(2)使用壓應力加載裝置,對體外培養(yǎng)的h PDLSCs施加100KPa的靜壓力,分別于加壓處理1h和12h后,收集樣品,檢測h PDLSCs成骨分化能力的改變。研究結(jié)果(1)使用有限稀釋法分離培養(yǎng)的h PDLSCs,克隆形成率為28%。干性鑒定結(jié)果顯示,干細胞標記物CD105、CD29、CD44和stro-1表達呈陽性,而CD34和CD45的表達呈陰性。ALP染色、茜素紅染色、Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,誘導后其成骨分化能力增強;油紅染色、Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,誘導后其成脂分化能力增強。(2)當100KPa的靜壓力作用1h時,ALP染色及其活性檢測結(jié)果顯示,h PDLSCs成骨分化能力增強;Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,h PDLSCs表達ALP和RUNX2明顯升高。而當壓力持續(xù)至12h時,ALP染色及其活性檢測結(jié)果顯示,h PDLSCs成骨分化能力降低;Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,ALP和RUNX2表達量下調(diào)。結(jié)論(1)通過有限稀釋法分離培養(yǎng)的h PDLSCs具有干細胞特性。(2)適宜的靜壓力在短時間內(nèi)上調(diào)了h PDLSCs的成骨能力,而長時間內(nèi)則對其起抑制作用。第三部分經(jīng)典Wnt信號通路對PDLSCs成骨分化能力的影響研究目的通過檢測壓力作用下經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)指標的表達變化以及調(diào)節(jié)通路后h PDLSCs成骨分化能力的改變,明確經(jīng)典Wnt信號通路對h PDLSCs成骨分化能力的影響。研究方法(1)組織切片免疫組化染色,觀察大鼠壓力側(cè)牙周膜內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路效應分子active-β-catenin的表達變化。(2)Western blot和RT-PCR檢測100KPa/1h和100KPa/12h的靜壓力作用下經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)指標的表達變化。(3)在100KPa/1h和100KPa/12h的壓力條件下,分別使用wnt3a和DKK1調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路后,ALP染色及其活性檢測觀察h PDLSCs成骨分化能力的改變,Western blot和RT-PCR檢測h PDLSCs表達ALP和RUNX2的變化。研究結(jié)果(1)免疫組化結(jié)果顯示,隨著加力時間的延長,大鼠壓力側(cè)牙周膜中active-β-catenin的表達呈上升趨勢。(2)Western blot結(jié)果顯示,當100KPa的靜壓力作用1h后,h PDLSCs表達P-GSK-3β、active-β-catenin和β-catenin下降,而GSK-3β的表達量上升;當壓力持續(xù)到12h時,檢測結(jié)果與上述相反。RT-PCR結(jié)果無統(tǒng)計學意義。(3)靜壓力作用下,上調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路后,ALP染色及其活性檢測結(jié)果顯示,h PDLSCs的成骨能力被抑制;Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,ALP和RUNX2的表達下降。而抑制經(jīng)典Wnt信號通路后,結(jié)果與上述相反。結(jié)論(1)經(jīng)典Wnt信號通路參與了OTM。(2)靜壓力在短時間內(nèi)抑制了經(jīng)典Wnt信號通路,而長時間則對其起促進作用。(3)靜壓力作用下,經(jīng)典Wnt信號通路對h PDLSCs的成骨分化起負調(diào)控作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R783.5
【目錄】：

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本文編號：174785