本文關(guān)鍵詞：柿鞣質(zhì)水提取液對牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學(xué)》 2015年

柿鞣質(zhì)水提取液對牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

劉曉禮  

【摘要】：牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)是牙周組織的重要組成部分,可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞,二者分別形成牙骨質(zhì)和牙槽骨,對牙周組織的修復(fù)具有十分重要的功能[l]。鞣質(zhì)具有顯著的收斂、抗氧化、解毒、抑菌及保護(hù)黏膜等作用。隨著人們對鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的深入研究,鞣質(zhì)在口腔臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也日益廣泛。柿子中含有豐富的鞣質(zhì)類物質(zhì),本研究使用經(jīng)乙醇超聲提取而出的柿鞣質(zhì)提取液,通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),采用MTT、考馬斯亮藍(lán)染色法、堿性磷酸酶法等實驗技術(shù),觀察柿鞣質(zhì)水提取液(persimmon tannin water extract)對PDLCs的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總蛋白含量及ALP活性的影響,探討柿鞣質(zhì)水提取液對人牙周組織修復(fù)再生功能的作用。目的:牙周病是口腔常見病和多發(fā)病,是一種發(fā)生在牙周支持組織上的、以細(xì)菌為主的感染性疾病,是成年人口腔中病理性失牙最主要的原因。很多學(xué)者對中藥在牙周病的治療和預(yù)防方面進(jìn)行了大量的研究,使用天然藥物防治口腔疾病越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。牙周組織再生是在細(xì)胞合成和分泌蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,細(xì)胞內(nèi)蛋白含量水平高低可以反映細(xì)胞功能旺盛與否;ALP活性的高低可反映PDLCs向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢。本實驗旨在體外原代培養(yǎng)PDLCs的基礎(chǔ)上,觀察不同濃度的柿鞣質(zhì)水提取液在不同時間點對PDLCs的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總蛋白含量及ALP活性的影響,明確其對人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖作用,為證實柿鞣質(zhì)具有促進(jìn)牙周健康提供實驗依據(jù)。方法:1柿果實鞣質(zhì)的提取:對全柿果實進(jìn)行超聲提取,并對柿鞣質(zhì)粗提取液進(jìn)行脫糖,超濾,得到分子量為10000的柿鞣質(zhì)溶液,利用Folin-Denis法測定提取液中鞣質(zhì)含量。取全柿鞣質(zhì)水提取液,使用0.22μm濾菌器過濾除菌,4℃避光保存?zhèn)溆谩?細(xì)胞培養(yǎng):取正畸需要拔除的無齲、無牙周病的10~16歲青少年前磨牙,隨即放置于含有雙抗預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中。在超凈工作臺內(nèi),無菌刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織,剪成l mm×l mm×l mm小塊后,平鋪于25 m L培養(yǎng)瓶中,從對側(cè)加入含有20%血清、0.1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基2 m L。在CO2培養(yǎng)箱中,37℃、5%CO2飽和條件下培養(yǎng)4 h后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,繼續(xù)培養(yǎng)。有細(xì)胞游出后,每隔3天換液。細(xì)胞長滿瓶底壁后,以0.25%胰蛋白酶消化,傳代。凡免疫組化角蛋白陰性、波形蛋白陽性的4~6代細(xì)胞用于實驗。配制系列濃度的柿鞣質(zhì)水提取液:柿鞣質(zhì)水提取液濃度依次為:0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088 mg/m L、0.147mg/m L、0.440 mg/m L及0 mg/m L(對照組)。MTT法測定細(xì)胞數(shù)量變化:取第5代細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/m L的細(xì)胞濃度接種到96孔板,每孔100?L,培養(yǎng)24 h后,吸棄原有培養(yǎng)液,用PBS液輕輕洗3次,吸干,每孔加入條件培養(yǎng)液200?L,每個濃度組6個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入MTT(0.5mg/m L)20??L,37℃、5%CO2飽和條件下培養(yǎng)4 h,吸棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150?L,振蕩10 min,于酶標(biāo)儀測定波長為490 nm處溶液的OD值�？捡R斯亮藍(lán)染色法測定細(xì)胞總蛋白含量:取第5代細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/m L的細(xì)胞濃度接種到96孔板,每孔100?L,培養(yǎng)24 h后,吸棄原有培養(yǎng)液,每孔加入條件培養(yǎng)液200?L,每個濃度組6個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入100?L 0.1%Triton X-100,室溫下振蕩30 min,觀察己無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后,吸取20?L,轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板,每孔加入考馬斯亮藍(lán)染液200?L,室溫下振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在590 nm波長處測定溶液的OD值。堿性磷酸酶法測細(xì)胞活性:取第5代細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105/m L的細(xì)胞濃度接種到96孔板,每孔100?L,培養(yǎng)24 h后,吸棄原有培養(yǎng)液,每孔加入條件培養(yǎng)液200?L,每個濃度組6個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,每孔加入100??L 0.1%Triton X-100,室溫下振蕩30 min,觀察己無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后,吸取50?L,轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板,每孔加入ALP底物染液100?L,37℃恒溫水浴10 min,每孔加0.2mol/L Na OH 50?L止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在410 nm波長處測定溶液的OD值。結(jié)果:1在24 h、48 h、72 h三個時間點,與對照組比較,不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞數(shù)量增長,且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088mg/m L、0.147 mg/m L及0.440 mg/m L),在24 h、48 h、72 h三個時間點均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞數(shù)量增長,且呈時間依賴性。2在24 h、48 h、72 h三個時間點,與對照組比較,不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞總蛋白的合成,且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088 mg/m L、0.147 mg/m L及0.440 mg/m L),在24 h、48 h、72 h三個時間點均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞總蛋白的合成,且呈時間依賴性。3在24 h、48 h、72 h三個時間點,與對照組比較,不同濃度柿鞣質(zhì)水提取液均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞活性增強(qiáng),且呈濃度依賴性。各種濃度柿鞣質(zhì)水提取液(0.0133 mg/m L、0.0259 mg/m L、0.0389 mg/m L、0.088mg/m L、0.147 mg/m L及0.440 mg/m L),在24 h、48 h、72 h三個時間點均能促進(jìn)人PDLCs細(xì)胞活性增強(qiáng),且呈時間依賴性。結(jié)論:柿鞣質(zhì)水提取液對人牙周膜成纖維細(xì)胞數(shù)量、總蛋白質(zhì)含量及細(xì)胞活性均具有時間依賴性和濃度依賴性。柿鞣質(zhì)水提取液能促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量增長,促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成,并使得細(xì)胞活性增強(qiáng),表明柿鞣質(zhì)水提取液具有促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的作用,從而為證實柿鞣質(zhì)在人牙周組織修復(fù)中具有促進(jìn)作用提供實驗依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

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本文編號：170599