本文關(guān)鍵詞：CYP19A1及雌激素對(duì)阿爾茨海默病作用的研究

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【摘要】：目的：探究CYP19A1基因的過(guò)表達(dá)及雌激素對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的影響,為闡述CYP19A1、雌激素與阿爾茨海默病的內(nèi)在關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1.取胎齡為18-19d的C57BL/6J胎鼠,分離海馬組織。采用胰酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),采用微管蛋白相關(guān)標(biāo)志物2(MAP2)及Hoechst 33258免疫熒光染色鑒定海馬神經(jīng)元純度。2.用Aβ25-35處理海馬神經(jīng)元建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型。設(shè)不同濃度梯度的Aβ25-35作用于海馬神經(jīng)元48h,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性,確定Aβ25-35最佳AD模型造模濃度。3.用不同濃度的17β-雌二醇作用加入到Aβ25-35處理的阿爾茨海默病細(xì)胞模型中,48h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性,以及用Hoechst 33258染核檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。4.利用模板質(zhì)粒H4134,采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出CYP19A1基因片段；用限制性內(nèi)切酶Spe I-HF和XbaI酶酶切pLenti-CMV-EGFP-P2A-MCS-3FLAG(H138)表達(dá)載體；使用無(wú)縫克隆試劑盒將CYP19A1基因片段和線性化載體連接；運(yùn)用PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆的pLenti-CMV-EGFP-P2A-CYP19A1載體。使用Obio轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行慢病毒包裝,運(yùn)用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)法行滴度檢測(cè)；并用重組慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(293T),觀察GFP表達(dá)并用Western Blot檢測(cè)目的質(zhì)粒的表達(dá)情況。從而構(gòu)建CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒。5.CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元,72h后用Aβ25-35處理造模。48h后,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性,用Hoechst 33258染核檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。成果：1.本課題所采用方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好,且能穩(wěn)定存活至3w；神經(jīng)元的純度可達(dá)95%。2.穩(wěn)定建立了海馬神經(jīng)元阿爾茨海默病細(xì)胞模型,確立Aβ25-35的造模濃度為20uM。3.10-4 mol/L、10-5mol/L濃度17β-雌二醇可對(duì)抗Aβ25-35處理的海馬神經(jīng)元阿爾茨海默病細(xì)胞模型的活性損傷和細(xì)胞凋亡,對(duì)海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。4.成功獲得了陽(yáng)性克隆的pLenti-CMV-EGFP-P2A-CYP19A1載體。并成功轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞,目的質(zhì)粒在細(xì)胞中成功表達(dá)。成功構(gòu)建了CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒。5. CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒能在海馬神經(jīng)元中成功轉(zhuǎn)染,海馬神經(jīng)元經(jīng)過(guò)CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染后能對(duì)抗Aβ25-35處理的海馬神經(jīng)元阿爾茨海默病細(xì)胞模型的活性損傷和細(xì)胞凋亡。結(jié)論：在阿爾茨海默病細(xì)胞模型中CYP19A1過(guò)表達(dá)及雌激素可對(duì)抗由Aβ25-35引起的活性損傷和細(xì)胞凋亡,即CYP19A1過(guò)表達(dá)及雌激素對(duì)阿爾茨海默病具有保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 雌激素 CYP19A1
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 第一章 文獻(xiàn)研究12-17
• 1.1 阿爾茨海默病12-13
• 1.1.1 概述12
• 1.1.2 流行病學(xué)12
• 1.1.3 病理特征及發(fā)病機(jī)制12-13
• 1.1.4 遺傳因素13
• 1.2 雌激素與阿爾茨海默病13-15
• 1.2.1 阿爾茨海默病患病率的性別差異13-14
• 1.2.2 雌激素對(duì)阿爾茨海默病的作用14
• 1.2.3 雌激素對(duì)阿爾茨海默病的作用機(jī)制14-15
• 1.3 CYP19A1與阿爾茨海默病15-17
• 1.3.0 CYP的簡(jiǎn)介15
• 1.3.1 CYP19A1的簡(jiǎn)介15
• 1.3.2 CYP19A1與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展15-17
• 第二章 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)與鑒定17-23
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.2 主要耗材17
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑17
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備17-18
• 2.1.5 主要溶液配制18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-20
• 2.2.1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)18-19
• 2.2.2 免疫熒光鑒定海馬神經(jīng)元19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-21
• 2.3.1 原代海馬神經(jīng)元20-21
• 2.3.2 海馬神經(jīng)元免疫熒光鑒定21
• 2.4 討論21-23
• 第三章 雌激素對(duì)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的阿爾茨海默病細(xì)胞模型的作用23-30
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 3.1.2 主要耗材23
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑23
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備23
• 3.1.5 主要溶液配制23-24
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法24-25
• 3.2.1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)24
• 3.2.2 藥物處理24
• 3.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)24-25
• 3.2.4 海馬神經(jīng)元凋亡的檢測(cè)25
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25-26
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 3.4.1 Aβ_(25-35)最佳造模濃度26
• 3.4.2 DMSO溶媒稀釋比的選擇26-27
• 3.4.3 17β-雌二醇對(duì)Aβ_(25-35)損傷的阿爾茨海默病細(xì)胞模型的作用27-29
• 3.5 討論29-30
• 第四章 CYP19A1過(guò)表達(dá)慢病毒的構(gòu)建及鑒定30-45
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 4.1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞30
• 4.1.2 主要耗材30
• 4.1.3 主要酶與試劑30
• 4.1.4 主要儀器設(shè)備30-31
• 4.1.5 1主要溶液配制31
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法31-41
• 4.2.1 CYP19A1熒光表達(dá)載體的構(gòu)建31-36
• 4.2.2 過(guò)表達(dá)CYP19A1的慢病毒包裝及純化36-41
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-44
• 4.3.1 CYP19A1序列的PCR擴(kuò)增41-42
• 4.3.2 CYP19A1載體酶切測(cè)序結(jié)果42-43
• 4.3.3 慢病毒滴度的測(cè)定43
• 4.3.4 目的質(zhì)粒的表達(dá)情況的檢測(cè)43-44
• 4.4 討論44-45
• 第五章 CYP19A1過(guò)表達(dá)對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的作用研究45-52
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45
• 5.1.2 主要耗材45
• 5.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑45
• 5.1.4 主要儀器設(shè)備45
• 5.1.5 主要溶液配制45
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 5.2.1 慢病毒感染海馬神經(jīng)元的最適感染復(fù)數(shù)的確定45-46
• 5.2.2 CCK-8檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)AD細(xì)胞模型活性影響46
• 5.2.3 Hoechst 33258檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)AD細(xì)胞模型凋亡的影響46-47
• 5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析47
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-50
• 5.4.1 最適感染復(fù)數(shù)的確定47-49
• 5.4.2 CYP19A1過(guò)表達(dá)對(duì)Aβ_(25-35)引起的海馬神經(jīng)元活性損傷的影響49
• 5.4.3 CYP19A1過(guò)表達(dá)對(duì)Aβ_(25-35)引起的海馬神經(jīng)元凋亡的影響49-50
• 5.5 討論50-52
• 結(jié)語(yǔ)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 附錄57-58
• 在校期間發(fā)表論文情況58-59
• 致謝59-60
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審核證明60

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本文編號(hào)：594503