本文關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激誘導小鼠海馬神經(jīng)元microRNA表達譜的改變及驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學》 2013年

miR-34c在快速老化小鼠海馬組織中的表達及其靶基因的初步鑒定

于文君  

【摘要】：目的：阿爾茨海默癥（Alzheimer’s Disease, AD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴重影響社會交往、就業(yè)與生活質(zhì)量，給個人、家庭和社會帶來沉重負擔。AD的病因和發(fā)病機制十分復雜，至今尚不完全清楚。目前存在多種學說，如氧化應(yīng)激學說、Aβ級聯(lián)學說、Tau蛋白假說、線粒體功能障礙學說、基因突變學說和自噬功能失調(diào)學說等。miRNAs是體內(nèi)重要的一種內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與mRNA3'-UTR結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用，在人體大約有20-30%的基因是受miRNA調(diào)控的。近年來，研究表明，miR-18b、 miR-325、miR-615等多個miRNAs在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的重要調(diào)節(jié)作用。盡管如此，失調(diào)的miRNAs在AD發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚不完全明確，是當前本領(lǐng)域研究的熱點問題。本研究通過對快速老化小鼠（Senescence AcceleratedMouse-Prone/8, SAMP8）海馬組織中miRNAs的表達譜進行分析，結(jié)合生物信息學、Real-time PCR和Western blot等方法，篩選并確定目標miRNAs及其靶基因，進一步采用熒光素酶實驗觀察miR-34c對其靶基因突觸結(jié)合蛋白(Synaptotagmin-1，syt1)的負向調(diào)控作用。為闡明miR-34c在AD發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及開發(fā)以miRNAs為靶點的藥物提供了新的思路。 方法：①法實驗動物：封閉群清潔級快速老化亞系SAMP8及抗快速老化亞系SAMR1(Senescence accelerated Mouse-Resistant/1, SAMR1)。②②SAMRn表達譜的檢測：采用miRNA基因芯片技術(shù)檢測SAMP8和正常同齡對照SAMR1鼠海馬組織中miRNA表達譜的改變情況。③③利用生物信息學方法進行KEGG分析，預測差異性表達的miRNAs可能參與的信號通路。④能差異性表達miRNA的驗證：通過Real-time PCR驗證目標miRNAmiR-34c在3月齡SAMP8和同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中的表達；進一步通過Real-time PCR檢測miR-34c在3月齡SAMR1小鼠腦、心、肝、腎等組織的表達和3，6和9月齡SAMP8和同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中的表達及增齡性改變。⑤增利用生物信息學方法進行GO分析，預測miR-34c的靶基因可能的生物功能。⑥靶基因的預測及驗證：利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫Targetsan6.2和Pictar、miRanda、RNA22、PITA綜合預測miR-34c的靶基因，通過Real-time PCR檢測3、6和9月齡SAMP8小鼠和正常同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中靶基因mRNA水平的表達，再分別通過Westernblot和免疫組化的方法對SAMP8和同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中靶基因蛋白的表達和定位進行分析。⑦行熒光素酶實驗：最后通過構(gòu)建靶基因3'-UTR熒光素酶報告載體，與miR-34c前體序列或抑制物共同轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。⑧胞統(tǒng)計方法：所有數(shù)據(jù)采用x|-±s表示。用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析和獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學分析，以P 0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：①果miRNA芯片結(jié)果：與正常同齡對照SAMR1相比，SAMP8海馬組織中表達差異在1.5倍以上的miRNAs有15個，其中7個表達下調(diào)，8個表達上調(diào)，且以miR-34c表達上調(diào)倍數(shù)最高，為2.52倍。②。對差異性表達的miRNAs進行的KEGG結(jié)果提示：差異表達的miRNAs的靶基因可能參與機體神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、軸突導向和突觸囊泡循環(huán)等信號通路，以及神經(jīng)元突觸的形成過程。③靶Real-time PCR檢測顯示，與同齡正常對照組SAMR1小鼠相比，3月齡SAMP8小鼠海馬組織中miR-34c表達增高（P0.05），與芯片結(jié)果一致；miR-34c在小鼠海馬和腦皮質(zhì)中的相對表達量明顯高于心、肝、腎組織（P 0.05）；與正常同齡對照組SAMR1相比，3，6和9月齡SAMP8小鼠海馬組織中miR-34c表達均顯著增高（P 0.05），且在SAMP8組呈增齡性表達增高（P 0.05）。④④0.分析結(jié)果提示，，miR-34c的靶基因可能參與軸突導向、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生等過程，并且參與突觸結(jié)構(gòu)的組成過程。⑤軟件預測miR-34c靶基因為突觸結(jié)合蛋白1（Synaptotagmin1，syt1），Real-time PCR檢測3，6和9月齡SAMR1和SAMP8海馬組織中syt1mRNA水平隨著月齡的增加而增高（P 0.05）。⑥Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常同齡對照組SAMR1相比，3，6和9月齡SAMP8小鼠海馬組織中SYT1蛋白水平明顯下調(diào)，且 呈增齡性下降（P 0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，SYT1蛋白主要表達在小鼠海馬組織的CA3區(qū)，DG區(qū)和CA1區(qū)幾乎沒有陽性表達。⑦達雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-34c前體組，熒光素酶活性明顯減低，轉(zhuǎn)染miR-34c抑制物組熒光素酶活性增高（P 0.05）。 結(jié)論：①論SAMP8小鼠海馬組織中多種miRNAs表達失調(diào)，可能通過神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、軸突導向和突觸囊泡循環(huán)通路參與腦老化及神經(jīng)系統(tǒng)退行疾病的發(fā)病過程。②行miR-34c可抑制其靶基因syt1蛋白的翻譯在AD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16
【目錄】：

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本文編號：244393