本文關(guān)鍵詞：基于miR30骨架的HPSE-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其效應(yīng)研究

  更多相關(guān)文章： 慢病毒屬 遺傳載體 RNA干擾 微RNAs RNA聚合酶Ⅱ 轉(zhuǎn)錄啟動子 葡糖醛酸糖苷酶 聚合酶鏈反應(yīng)

【摘要】：目的:模擬miR30的框架結(jié)構(gòu)設(shè)計針對HPSE的shRNA,將其克隆至慢病毒載體的CMV啟動子調(diào)控的表達(dá)框內(nèi),實現(xiàn)Ⅱ型啟動子對RNAi的有效調(diào)控。方法:設(shè)計3條基于miR30骨架的HPSE-shRNA,通過PCR獲得目的片段,回收后與線性化LV PP-GFP載體連接產(chǎn)生重組慢病毒載體LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA,PCR篩選陽性克隆,測序鑒定。用LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞,產(chǎn)生慢病毒,感染A375細(xì)胞。以實時熒光定量PCR檢測HPSE-mRNA的表達(dá)情況,以Westen blot檢測HPSE蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:構(gòu)建出以miR30為骨架的針對HPSE的慢病毒干擾載體,經(jīng)陽性菌落PCR鑒定與測序,結(jié)果正確。實時熒光定量PCR和Westen blot結(jié)果表明,LV PP-GFP/miR-HPSE-shRNA重組病毒感染后A375細(xì)胞HPSE-mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了以miR30為骨架的HPSE-shRNA慢病毒載體,實現(xiàn)了Ⅱ型啟動子對RNAi的有效調(diào)控,為今后實現(xiàn)溶瘤病毒介導(dǎo)RNAi提供了實驗依據(jù)。
【作者單位】： 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科;
【關(guān)鍵詞】： 慢病毒屬 遺傳載體 RNA干擾 微RNAs RNA聚合酶Ⅱ 轉(zhuǎn)錄啟動子 葡糖醛酸糖苷酶 聚合酶鏈反應(yīng)
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(30771944)
【分類號】：R346
【正文快照】： RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,其作用機制是通過活化的小干擾RNA(smallinterference RNA,siRNA)靶向降解目的mRNA,從而使目的基因表達(dá)沉默,是目前簡單而高效的阻斷哺乳動物細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá)的最有效方法之一。microRNA(miRNA)是一類

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本文編號：727122