本文關(guān)鍵詞：生物素AP-tagged-FOXMl的表達(dá)體系構(gòu)建及蛋白互作初探

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【摘要】：生物素AP-tag技術(shù)是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個(gè)氨基酸(GLND IFEAQKIEWHE)組成的受體肽(acceptor peptide, AP)小標(biāo)簽,該小標(biāo)簽可被生物素連接酶BirA特異性識(shí)別,BirA酶可催化生物素轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)蛋白標(biāo)簽上的賴氨酸殘基上,導(dǎo)致帶有標(biāo)簽的靶標(biāo)蛋白在體內(nèi)或體外都能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應(yīng),反應(yīng)條件相當(dāng)溫和而且標(biāo)記的專一性極高。生物素AP-tag技術(shù)具有高效、位點(diǎn)特異及操作方便等特點(diǎn),同時(shí)由于序列短小,對(duì)靶標(biāo)蛋白的構(gòu)象及活性影響極低。鏈霉親和素可以專一地與生物素結(jié)合,且兩者間的結(jié)合力是自然界已知的最強(qiáng)的非共價(jià)結(jié)合作用力,結(jié)合常數(shù)Kd值高達(dá)10-15mol/L,比抗原與抗體間的結(jié)合力高1萬倍。因此,可在嚴(yán)格的洗脫條件下分離出目標(biāo)蛋白及其蛋白特異性相互作用的復(fù)合物。FOXM1是Forkhead box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,它與細(xì)胞增殖、衰老、DNA損傷修復(fù)、再生和腫瘤等許多生理病理過程都有密切關(guān)系。本課題構(gòu)建基于生物素AP-tag的FOXM1真核表達(dá)載體,利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結(jié)合性質(zhì)對(duì)FOXM1蛋白進(jìn)行純化,為后續(xù)鑒定其互作分子的研究奠定基礎(chǔ)。分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-AP-FOXM1和大腸桿菌生物素連接酶BirA真核表達(dá)載體pcDNA-BirA,將pcDNA-AP-FOXM1和pcDNA-BirA共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞,使用鏈霉親和素瓊脂糖珠純化生物素標(biāo)記的FOXM1,通過銀染及Western印跡檢測(cè)細(xì)胞裂解液以及親和純化后的蛋白復(fù)合物,確定了相關(guān)蛋白表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)AP-FOXM1在HEK293T細(xì)胞中被生物素化且該蛋白在Western印跡、pull down等實(shí)驗(yàn)中可實(shí)現(xiàn)無需抗體的一步法應(yīng)用。另外,分別構(gòu)建了的pcDNA-AP-FOXM1 (1-224aa)和pcDNA-AP-FOXM1(1-353aa),在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)不同長度的可生物素化的FOXM1,并驗(yàn)證了FOXM1的互作蛋白p-catenin與FOXM1的C端發(fā)生互作,為研究FOXM1與其他蛋白的細(xì)節(jié)互作關(guān)系提供了有效工具。
【關(guān)鍵詞】：生物素AP-tag FOXM1 BirA酶 親和純化 蛋白互作
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 生物素AP-tag技術(shù)概述10-11
• 1.2 生物素連接酶BirA的簡介11-13
• 1.2.1 生物素簡介11-12
• 1.2.2 生物素連接酶BirA概述12
• 1.2.3 BirA酶的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2.4 BirA酶的功能13
• 1.3 鏈霉親和素簡介13-14
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的概述14-17
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的結(jié)構(gòu)14
• 1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的功能14-17
• 1.5 β-catenin的概述17
• 1.6 FOXM1蛋白互作概述17-18
• 1.7 研究目的、內(nèi)容與意義18-21
• 第2章 生物素化FOXM1真核表達(dá)體系的構(gòu)建21-36
• 2.1 前言21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器21-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 2.3.1 BirA酶重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建23-29
• 2.3.2 生物素化FOXM1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建29-32
• 2.4 結(jié)果與分析32-35
• 2.4.1 pcDNA-BirA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定32-33
• 2.4.2 pcDNA-AP-FOXM1重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定33-35
• 2.5 本章小結(jié)35-36
• 第3章 AP-FOXM1的生物素化和純化36-47
• 3.1 前言36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器36-38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法38-43
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)38-39
• 3.3.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)39
• 3.3.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)39-42
• 3.3.4 蛋白純化42
• 3.3.5 硝酸銀染色42-43
• 3.4 結(jié)果與分析43-46
• 3.4.1 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)及生物素化43-44
• 3.4.2 生物素化的AP-FOXM1一步純化44-45
• 3.4.3 生物素化的FOXM1硝酸銀染色分析45-46
• 3.5 本章小結(jié)46-47
• 第4章 生物素AP-tagged-FOXM1的蛋白互作初步研究47-57
• 4.1 前言47-48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器48-50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法50-54
• 4.3.1 pcDNA3.1-AP-FOXM1不同片段長度重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定50-53
• 4.3.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)53
• 4.3.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)53-54
• 4.3.4 蛋白純化54
• 4.4 結(jié)果與分析54-56
• 4.4.1 pcDNA-AP-FOXM1不同片段長度重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定54
• 4.4.2 基于生物素AP-tag技術(shù)的FOXM1的互作蛋白檢測(cè)54-56
• 4.5 本章小結(jié)56-57
• 總結(jié)與展望57-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 附錄A 英文縮寫65-66
• 附錄B 常用緩沖液和試劑配方66-67
• 附錄C 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄67-68
• 致謝68

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王義琴,孫勇如;生物素-親合素系統(tǒng)及其應(yīng)用[J];高技術(shù)通訊;2000年03期

2 白麗;生物素化抗細(xì)胞因子單克隆抗體的制備[J];免疫學(xué)雜志;2001年03期

3 方華豐,周宜開,任恕;生物素化殼聚糖微球的體外抗癌活性[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2000年05期

4 宋娜;郝友華;張正茂;吳s，

本文編號(hào)：722181