本文關(guān)鍵詞：溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)“針狀樣”毒力裝置相關(guān)基因功能的研究

  更多相關(guān)文章： 溶藻弧菌 vscP vscX III型分泌系統(tǒng) 免疫保護(hù) 蛋白質(zhì)組

【摘要】：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)III型分泌系統(tǒng)的“針狀樣”毒力裝置(Needle-like injectisome)又稱為注射小體,是III型分泌系統(tǒng)中一個(gè)復(fù)雜的微型裝置,負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白傳輸?shù)秸婧思?xì)胞。注射裝置從細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)向外伸出內(nèi)中空的針到達(dá)宿主細(xì)胞表面,該注射過(guò)程一共橫跨三層膜。本研究成功克隆并分析了注射裝置上兩個(gè)重要因子:vscP基因和vscX基因。vscP基因ORF為1206 bp,共編碼401個(gè)氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為44.4 kD,等電點(diǎn)為5.72。構(gòu)建VscP亞基三維結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn),其與鞭毛FilK蛋白有相似構(gòu)型。vscX基因ORF為378 bp,共編碼125個(gè)氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為14.2 kD,等電點(diǎn)為5.75。網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果顯示vscX與vsc Y、vopB、sycN等有相鄰的關(guān)系。VscP和VscX各自具有一個(gè)重要結(jié)構(gòu)域,分別是T3S4(369-389aa)結(jié)構(gòu)域和Pfam(1-125aa)結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),結(jié)合2-△△Ct法分析VscP和VscX在分別在溶藻弧菌野生株HY9901、III型分泌系統(tǒng)護(hù)航蛋白缺失株△vscO和互補(bǔ)株C-vscO菌株中不同生長(zhǎng)時(shí)期的mRNA表達(dá)差異。結(jié)果顯示,VscP和VscX的mRNA表達(dá)量均隨溶藻弧菌HY9901生長(zhǎng)而增長(zhǎng),在生長(zhǎng)平緩期顯著上調(diào)(p0.01)。在vscO基因缺失后,VscP和VscX的mRNA表達(dá)量均在生長(zhǎng)晚期顯著上調(diào)(p0.01),說(shuō)明vscO的缺失破壞了VscO與VscP、VscX之間的協(xié)同關(guān)系,使得VscP和VscX在生長(zhǎng)晚期表達(dá)過(guò)剩。選取VscP抗原制備亞單位疫苗,首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-vscP,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá);然后以28℃,0.4 mM IPTG,5 h的最優(yōu)條件培養(yǎng)獲得重組蛋白,并用GST標(biāo)簽的純化柱純化;最后,VscP抗原免疫多鱗淶(Sillago sihama Forskál),溶藻弧菌、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒兩周后,VscP抗原對(duì)多鱗淶的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為67.7%、86.6%,說(shuō)明VscP抗原有望成為制備具有交叉保護(hù)作用的亞單位疫苗的良好材料。首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究VscP蛋白免疫多鱗淶后其脾臟蛋白的表達(dá)差異,應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行分離鑒定,結(jié)果表明,VscP蛋白免疫組所得蛋白點(diǎn)為1316個(gè),免疫前對(duì)照組所得蛋白點(diǎn)為1149個(gè),PBS對(duì)照組所得蛋白點(diǎn)為1291個(gè),PBS+佐劑對(duì)照組所得蛋白點(diǎn)為1316個(gè)。與對(duì)照組相比,在免疫組發(fā)現(xiàn)9個(gè)差異蛋白,5個(gè)為上調(diào)表達(dá)的蛋白和4個(gè)為新增蛋白,為進(jìn)一步研究其免疫保護(hù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：溶藻弧菌 vscP vscX III型分泌系統(tǒng) 免疫保護(hù) 蛋白質(zhì)組
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 文獻(xiàn)綜述9-19
• 1.1 海水養(yǎng)殖中的弧菌9-10
• 1.1.1 溶藻弧菌9-10
• 1.1.2 哈維氏弧菌10
• 1.2 III型分泌系統(tǒng)10-14
• 1.2.1 T3SS“針狀樣”裝置的結(jié)構(gòu)11
• 1.2.2 T3SS的侵染11-14
• 1.3 弧菌的病害防治14-15
• 1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)在海洋生物中的研究進(jìn)展15-17
• 1.5 技術(shù)路線17-18
• 1.6 研究目的及意義18-19
• 2 溶藻弧菌vscP和vscX基因的克隆和熒光定量PCR19-37
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒19
• 2.1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器19-21
• 2.2 方法21-24
• 2.2.1 細(xì)菌總DNA的提取21
• 2.2.2 vscP和vscX基因的克隆21
• 2.2.3 目的片段的連接，轉(zhuǎn)化和測(cè)序21-22
• 2.2.4 生物信息學(xué)分析22
• 2.2.5 熒光定量PCR22-24
• 2.3 結(jié)果24-34
• 2.3.1 vscP基因的克隆分析24-30
• 2.3.2 vscX基因的克隆分析30-34
• 2.3.3 RT-PCR34
• 2.4 討論34-37
• 3 溶藻弧菌VscP蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)性分析37-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒載體37
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器37-38
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑38
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)魚體38
• 3.2 方法38-41
• 3.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建38-39
• 3.2.2 VscP蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化39
• 3.2.3 VscP蛋白的純化與定量39-40
• 3.2.4 VscP蛋白對(duì)多鱗淶的免疫保護(hù)率40-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析41-45
• 3.3.1 vscP基因的原核表達(dá)41-44
• 3.3.2 VscP蛋白對(duì)多鱗淶的免疫保護(hù)性分析44-45
• 3.4 討論45-47
• 4 Vsc P蛋白免疫多鱗淶脾臟蛋白質(zhì)組學(xué)初步分析47-54
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料47
• 4.1.1 主要儀器47
• 4.1.2 主要試劑47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 4.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備47-48
• 4.2.2 蛋白質(zhì)的純化與定量48
• 4.2.3 雙向電泳48-49
• 4.3 結(jié)果49-52
• 4.3.1 對(duì)照組與免疫組脾臟SDS-PAGE比較49
• 4.3.2 VscP免疫多鱗淶脾臟蛋白的 2-DE圖譜49-52
• 4.4 討論52-54
• 5 結(jié)論54-55
• 5.1 溶藻弧菌T3SS“針狀樣”毒力裝置相關(guān)基因的克隆和生物信息學(xué)分析54
• 5.2 溶藻弧菌T3SS“分子尺”VscP蛋白的表達(dá)和免疫保護(hù)54
• 5.3 VscP蛋白免疫多鱗淶脾臟蛋白質(zhì)組學(xué)初步分析54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 致謝63-64
• 作者簡(jiǎn)歷64-65
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：620669