本文關(guān)鍵詞：3D打印結(jié)構(gòu)性微環(huán)境調(diào)控表皮細(xì)胞分化為汗腺的效應(yīng)研究

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【摘要】：背景：皮膚中所生長(zhǎng)的汗腺組織具有重要的分泌汗液、排泄廢物的作用,對(duì)維持皮膚健康、機(jī)體體溫平衡尤為關(guān)鍵。一旦汗腺組織遭到大面積的破壞便會(huì)導(dǎo)致機(jī)體大量汗液排出體外障礙,所造成的缺陷將嚴(yán)重地影響患者的生活質(zhì)量。例如在炎熱氣候,體育鍛煉或發(fā)熱等情況下,如果汗腺功能失調(diào)可導(dǎo)致高體溫,中風(fēng),甚至死亡。皮膚損傷(包括燒傷、戰(zhàn)傷以及其它物理與化學(xué)等因素造成的損傷)也會(huì)導(dǎo)致汗腺功能受損,盡管目前我國(guó)燒傷早期救治處于國(guó)際領(lǐng)先水平,但令人遺憾的是存活患者皮膚多為瘢痕修復(fù),皮膚附件如汗腺、毛囊以及皮脂腺等缺乏的問題尚待解決,因而并不能算是真正意義上的修復(fù)與再生。目前,基于小鼠汗腺模型的研究表明在足趾墊部分存在有助于創(chuàng)面修復(fù)的干細(xì)胞群。然而,這些汗腺細(xì)胞修復(fù)活動(dòng)的分子機(jī)制以及在重度皮膚損傷累及汗腺的情況下還能否發(fā)揮其修復(fù)功能等問題上還是未知數(shù)。在這種創(chuàng)傷條件下,遭創(chuàng)區(qū)域的全層皮膚組織結(jié)構(gòu)都已遭到破壞,汗腺組織的嚴(yán)重結(jié)構(gòu)性毀損必將形成,依賴自身原位細(xì)胞的分裂、增殖與分化來實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重建顯得尤為困難,而且有研究表明創(chuàng)面周邊的正常汗腺細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)過程中呈靜息狀態(tài),因此很難使其自行趨化至創(chuàng)面修復(fù)已缺損汗腺的功能。汗腺的再生將有效地提高損傷修復(fù)過程中局部皮膚組織的環(huán)境適應(yīng)能力,更重要的是最終能恢復(fù)患者正常的排汗功能。汗腺再生的縱深研究能夠?yàn)樘岣邉?chuàng)傷救治及愈合的質(zhì)量提供更多強(qiáng)力的支撐,因此具有急迫的臨床需求。汗腺和其他皮膚附件一樣是由表皮前體細(xì)胞自胚胎期分化形成。然而,不同于已為人熟知的毛囊、皮脂腺等其他表皮衍生物,關(guān)于汗腺的研究十分有限。但目前可以確定的觀點(diǎn)均認(rèn)為表皮來源的干細(xì)胞／祖細(xì)胞仍是最具代表性且最有希望的再生汗腺種子細(xì)胞。然而多向分化潛能是表皮干(祖)細(xì)胞的突出特性,要實(shí)現(xiàn)其往汗腺定向分化需要構(gòu)造出特定的微環(huán)境。不同組的研究結(jié)果共同發(fā)現(xiàn),汗腺的萌發(fā)生長(zhǎng)依賴于表皮的基底膜區(qū)生理性穩(wěn)定以及真皮-表皮間的相互作用,其中汗腺生長(zhǎng)周圍的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是重要因素之一。ECM成分作為具有生物作用的功能活性區(qū)域,發(fā)揮與細(xì)胞的定向分化緊密關(guān)聯(lián)的作用。ECM內(nèi)容不僅能夠引導(dǎo)內(nèi)在細(xì)胞的表型發(fā)生改變,而且可通過自身動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)改建與活性改變來影響內(nèi)在細(xì)胞的生物學(xué)行為及細(xì)胞命運(yùn)。另外,許多種類的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、骨形成蛋白-4(BMP-4)等的作用都證實(shí)能夠發(fā)揮生物學(xué)作用影響汗腺的發(fā)生與功能。我們所在的研究小組也在汗腺發(fā)育基因表達(dá)規(guī)律、汗腺主要標(biāo)志物鑒別等方面進(jìn)行了前期研究�，F(xiàn)有結(jié)果表明,汗腺細(xì)胞的增殖、分化和汗腺形態(tài)發(fā)生受到多種信號(hào)分子、生長(zhǎng)因子和ECM成分的調(diào)控。鑒于這些發(fā)現(xiàn),汗腺發(fā)生區(qū)域真皮組分和生長(zhǎng)因子是ECM中決定表皮祖細(xì)胞命運(yùn)最為至關(guān)重要的因素。近年來,隨著生物材料在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普及應(yīng)用,在體外建立適合干細(xì)胞生長(zhǎng)并影響其生物學(xué)行為的微環(huán)境成為可能。在眾多發(fā)展起來的及發(fā)展中的生物材料與組織工程新生技術(shù)中,3D生物打印技術(shù)因具有多方面的優(yōu)勢(shì)而獲得重視并得到廣泛應(yīng)用。以往細(xì)胞生長(zhǎng)在平坦表面形態(tài)的二維結(jié)構(gòu)中會(huì)失去其在組織中的基本功能并表現(xiàn)出不同形態(tài),而且細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用也與體內(nèi)大不相同。而3D生物打印技術(shù)既能克服如此不足,彌補(bǔ)調(diào)控在空間上的缺陷,給細(xì)胞提供更多足夠的活動(dòng)空間,而且還有利于血管和神經(jīng)的爬布生長(zhǎng),從而更好更完整地模擬出細(xì)胞的自然微環(huán)境(niche),進(jìn)而促細(xì)胞增殖、分化。尤其突出的是,3D生物打印技術(shù)具有高精度和構(gòu)建速度快的特點(diǎn),不僅可以在三維層面確保不同種類細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生物活性因子的位置和分布的準(zhǔn)確性,而且異質(zhì)的種子細(xì)胞和支架材料加入到同步的3D打印體系則能更利于整體三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。盡管按照目前的技術(shù)水準(zhǔn)及制作工藝,利用3D打印技術(shù)所構(gòu)建出的三維組織結(jié)構(gòu)仍較為簡(jiǎn)單,但3D生物打印技術(shù)在組織工程中應(yīng)用的可行性已經(jīng)足以現(xiàn)有的研究工作所證實(shí),這一點(diǎn)在本人所在實(shí)驗(yàn)室小組的前期研究中已經(jīng)得到證實(shí)�；�3D生物打印基礎(chǔ)構(gòu)建的天然材料基質(zhì)復(fù)合生長(zhǎng)因子以及真皮基質(zhì)成分后,能夠最大限度地模擬出誘導(dǎo)表皮來源的祖細(xì)胞定向分化為汗腺細(xì)胞的微環(huán)境,而移植于皮膚全層缺損的創(chuàng)面后能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合,再生出汗腺組織。如通過設(shè)計(jì)將以上新技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化并合理應(yīng)用于汗腺再生研究,有望真正實(shí)現(xiàn)汗腺再生治療的臨床轉(zhuǎn)化,并為新時(shí)期下的再生醫(yī)學(xué)研究提供更具有效性的以及個(gè)性化需求的創(chuàng)新策略。目的：該研究的目的和設(shè)計(jì)是建立基于3D生物打印平臺(tái)的、具有誘導(dǎo)表皮祖細(xì)胞定向分化為汗腺細(xì)胞潛在能力的優(yōu)化方案,并由此探討其分化過程中打印結(jié)構(gòu)對(duì)汗腺再生效果的影響和作用機(jī)制,使其更有利于實(shí)現(xiàn)向汗腺再生研究的臨床轉(zhuǎn)化。方法：1.表皮祖細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定：首先從出生前12.5天(E12.5)雌性GFP-C57/B16小鼠(Jackson Laboratory)的背部皮膚中獲取表皮干細(xì)胞,采用本研究小組所在實(shí)驗(yàn)室已較成熟的培養(yǎng)系統(tǒng),對(duì)表皮祖(干)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定。2.真皮基質(zhì)成分獲�。喝コl(fā)后從野生C57/B16小鼠的足趾墊區(qū)(汗腺發(fā)生的微環(huán)境)獲取真皮并制成真皮基質(zhì)勻漿(PD),同時(shí)獲取小鼠背側(cè)真皮基質(zhì)(非汗腺發(fā)生的微環(huán)境)勻漿作為對(duì)照(DD)。3.生物打印油墨(bioink)制備以及打印過程：通過3D生物打印機(jī)(Regenovo 3D生物打印機(jī),中國(guó))突出的3D快速成型技術(shù),按照1：9的比例將1ml富集的表皮祖細(xì)胞懸液(1×107cell/ml)和真皮基質(zhì)勻漿(1ml),加入到20%的明膠(12ml)和4%的海藻酸鈉(6m1)的混合水凝膠中,將上述混合成分封裝入事先消毒好的兩種不同打印直徑(300μm、400μm)的打印容器中按照設(shè)計(jì)的模型打印出多孔性三維結(jié)構(gòu)體。打印樣品用熒光顯微鏡進(jìn)行原位的觀察。4.細(xì)胞活性和生長(zhǎng)因子釋放活性檢測(cè)：活細(xì)胞計(jì)數(shù)法原位分層檢測(cè)體外培養(yǎng)1-14天過程中模型中細(xì)胞的增殖以及活性。已有研究證明,真皮基質(zhì)成分中BMP-4的含量在表皮系細(xì)胞向汗腺分化過程中起重要調(diào)控作用。而在本研究中,隨打印墨水中明膠成分的降解,誘導(dǎo)成分中BMP-4也會(huì)隨之釋放。因此,用HE染色法檢測(cè)降解水平并用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(Elisa)法檢測(cè)1-14天打印體所釋放的BMP-4濃度。5.細(xì)胞定向分化能力檢測(cè)：培養(yǎng)1-14天后檢測(cè)模型固定并制成切片做免疫組化染色,檢測(cè)細(xì)胞的表皮基底細(xì)胞角蛋白CK5,CK14和汗腺管腔細(xì)胞角蛋白CK18,CK19的蛋白表達(dá)水平。培養(yǎng)1-28天后觀察打印體中的汗腺組織形成情況。結(jié)果：本研究建立的基于兩種不同打印直徑(300μm、400μm)打印噴頭的多孔性打印體在孔徑大小以及空間微結(jié)構(gòu)上有所區(qū)別,但所有打印模型中各層均可保持細(xì)胞活力且細(xì)胞分布較為均勻,具有可重復(fù)性和均一性。復(fù)合PD組所打印的3D細(xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞增殖、降解效果以及BMP-4釋放等特性上無顯著差異,且均可以誘導(dǎo)表皮祖細(xì)胞向汗腺分化。但是,與400μm組相比,300gm噴頭復(fù)合PD組(300μmPD+)打印出的3D細(xì)胞外基質(zhì)中細(xì)胞密度更高且在更短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了汗腺細(xì)胞標(biāo)志物的強(qiáng)表達(dá)。更為顯著的是,300μmPD+組是唯一能夠觀察到明顯汗腺組織形態(tài)發(fā)生的打印模型,而其余組均未見明顯汗腺組織形成。將已經(jīng)分化的汗腺細(xì)胞或者形成的汗腺組織脫離開3D打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行2D培養(yǎng)后則發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分化終止或不再形成組織。結(jié)論：本研究立足于以發(fā)展成熟的應(yīng)用基礎(chǔ)學(xué)科(組織工程、生物材料)為基礎(chǔ),結(jié)合3D生物打印的創(chuàng)新技術(shù)平臺(tái),模擬構(gòu)建使表皮干細(xì)胞能定向分化為汗腺的微環(huán)境模型,在時(shí)間空間點(diǎn)的可控性和直觀性上為體外汗腺再生研究提供了良好基礎(chǔ)；同時(shí)3D生物打印技術(shù)也優(yōu)化了模型構(gòu)建模式,使其比傳統(tǒng)組織工程模式更具科學(xué)性和應(yīng)用價(jià)值。此外,本研究是在對(duì)汗腺發(fā)生發(fā)育的基本規(guī)律和形態(tài)結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上,依托3D生物打印技術(shù)實(shí)施完成的,前期研究的基礎(chǔ)已經(jīng)為探討3D生物打印皮膚微環(huán)境對(duì)表皮干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵作用研究提供了可靠的證據(jù)。本研究也再次明確了表皮來源的成體干細(xì)胞可借由3D打印的特定微環(huán)境用有效的分化為汗腺細(xì)胞。更為重要的是,本研究結(jié)果充分證明了3D生物打印的多孔狀結(jié)構(gòu)對(duì)表皮祖細(xì)胞向汗腺的的分化乃至汗腺組織的形成具有實(shí)質(zhì)性的作用,這不僅是為探索汗腺再生機(jī)理和功能重建提供了全新的研究策略,也為探討3D打印的空間結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響以及誘導(dǎo)組織再生的基礎(chǔ)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)優(yōu)化的打印策略也為成體干細(xì)胞誘導(dǎo)汗腺再生的臨床轉(zhuǎn)化研究奠定了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：汗腺再生 干細(xì)胞 3D生物打印 組織工程
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R339.11
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第1章 研究背景16-26
• 1.1 汗腺再生研究的重要性16-17
• 1.2 汗腺再生的研究現(xiàn)狀17-20
• 1.3 3D細(xì)胞外基質(zhì)20-22
• 1.4 組織工程中的3D微結(jié)構(gòu)制造22-24
• 1.5 本研究的意義24-26
• 第2章 材料與方法26-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-32
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑26-28
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器28-30
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)溶液的配制30-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-46
• 2.2.1 小鼠胚胎EP的提取及培養(yǎng)33-34
• 2.2.2 天然SGC分化誘導(dǎo)劑PD的制備34-35
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及bioink的制備35-36
• 2.2.4 3D生物打印的流程36-40
• 2.2.5 細(xì)胞活力與增殖的測(cè)定40-41
• 2.2.6 HE染色及免疫熒光檢測(cè)41-43
• 2.2.7 骨形態(tài)發(fā)生蛋白濃度測(cè)定43
• 2.2.8 小鼠汗腺細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定43-45
• 2.2.9 數(shù)據(jù)分析45-46
• 第3章 結(jié)果46-56
• 3.1 3D打印體的特征46-47
• 3.2 3D多孔性打印體細(xì)胞活力及增殖47-48
• 3.2.1 打印體維持較高的細(xì)胞活力47
• 3.2.2 細(xì)胞于打印體中保持增殖能力47-48
• 3.3 3D多孔性打印體的降解及BMP4釋放48-51
• 3.3.1 打印體的緩慢降解48-49
• 3.3.2 BMP4的穩(wěn)定釋放49-51
• 3.4 3D多孔性打印體的汗腺細(xì)胞分化51-54
• 3.5 3D多孔性打印體中典型汗腺樣組織的形成54-56
• 第4章 討論56-58
• 第5章 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果65-66
• 中英文符號(hào)對(duì)照說明表66-68
• 致謝68-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Morphological and distribution characteristics of sweat glands in hypertrophic scar and their possible effects on sweat gland regeneration[J];Chinese Medical Journal;2005年03期

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本文編號(hào)：606521