發(fā)布時(shí)間：2017-07-17 13:24

  本文關(guān)鍵詞：人HVEM-Fc融合蛋白的制備及其生物學(xué)特性

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【摘要】：為建立CHO/HVEM-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,使之能穩(wěn)定分泌HVEM-Fc融合蛋白,采用常規(guī)PCR法分別從本單位已構(gòu)建的重組載體pGEZ-Term/B7-H1-Fc和pIRES2-EGFP/HVEM上擴(kuò)增人IgG1(Fc)恒定區(qū)和人HVEM胞外段編碼基因,XhoⅠ和Bam HI雙酶切人IgG1(Fc)恒定區(qū)及真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP,將兩種酶切的目的產(chǎn)物連接為pIRES2-EGFP/Fc,同時(shí)將獲得的人HVEM胞外段基因片段經(jīng)XhoⅠ和NheⅠ酶切后插入上述pIRES2-EGFP/Fc構(gòu)建成pIRES2-EGFP/HVEM-Fc重組載體,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染倉鼠卵巢癌CHO細(xì)胞,培養(yǎng)基中添加G418長期篩選并將分泌目的蛋白的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株亞克隆化。流式細(xì)胞術(shù)檢測HVEM-Fc融合蛋白的表達(dá),收集含融合蛋白的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清,Protein G親和層析柱對其進(jìn)行純化,Western blot定性分析。MTT檢測HVEM-Fc融合蛋白體外對抗人CD3單抗聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/LIGHT刺激的T淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHO/HVEM-Fc分泌的HVEM-Fc融合蛋白能與L929/LIGHT細(xì)胞有效結(jié)合,純化后的蛋白經(jīng)Western blot鑒定出現(xiàn)特異性清晰條帶,并且HVEM-Fc融合蛋白對L929/LIGHT協(xié)同刺激的T細(xì)胞體外增殖具有抑制作用。
【作者單位】： 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省臨床免疫研究所;蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院;蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所;
【關(guān)鍵詞】： 單純皰疹病毒侵入介質(zhì)(HVEM) 融合蛋白 共刺激分子 T細(xì)胞
【基金】：國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(30930085);國家自然科學(xué)基金(30600548) 蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃(SYS201101) 江蘇省青藍(lán)工程人才基金
【分類號(hào)】：R392.12
【正文快照】： 適度、有效免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、發(fā)生、發(fā)展取決于正性和負(fù)性共刺激分子間的平衡[l，’」。作為TNF超家族成員之一的LIGHT與其受體分子HVEM結(jié)合可促進(jìn)T細(xì)胞活化與增值〔，一5〕，而此正性信號(hào)的過度表達(dá)可誘發(fā)自身免疫疾病和移植時(shí)GVHD的發(fā)生，應(yīng)用LIGHT抗體或其受體的融合蛋白阻

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本文編號(hào)：553809