目的:對(duì)免疫相關(guān)GTP結(jié)合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,為深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。方法:使用國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫查詢獲取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息學(xué)在線分析工具對(duì)GIMAP2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、核定位信號(hào)(nuclear localization signal,NLS)、核輸出信號(hào)(nuclear export signal,NES)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析預(yù)測。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增GIMAP2基因片段,并插入至p QCXIP-mCherry-N1表達(dá)載體,用氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。測序正確的重組質(zhì)粒p QCXIP-GIMAP2-mCherry經(jīng)過提取、純化步驟后,與逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒VSVG、Gag/Pol在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共同轉(zhuǎn)入HEK293FT細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436。使用免疫熒光染色方法檢測內(nèi)、外...

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圖1GIMAP2蛋白生物信息學(xué)分析

根據(jù)pQCXIP-GIMAP2-mCherry表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖(圖2A)，以pBABE-GIMAP2-EGFP質(zhì)粒為模板，GIMAP2-F、GIMAP2-R為引物擴(kuò)增GIMAP2基因片段，其PCR產(chǎn)物大小為1033bp。DNA凝膠電泳結(jié)果顯示，與預(yù)期大小相符(圖2B)。....

圖2pQCXIP-GIMAP2-mCherry重組載體構(gòu)建過程

圖1GIMAP2蛋白生物信息學(xué)分析2.3內(nèi)源性、外源性GIMAP2蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞內(nèi)共定位

圖3內(nèi)源性、外源性GIMAP2蛋白在MDA-MB-436細(xì)胞內(nèi)共定位

將穩(wěn)定表達(dá)GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔接種在含蓋玻片的12孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)12h。經(jīng)固定、透膜、封閉、兔抗人GIMAP2抗體免疫染色等步驟后，激光共聚焦顯微鏡下觀察GIMAP2蛋白的定位情況，結(jié)果顯示抗體標(biāo)記的GIMAP....

圖4GIMAP2-mCherry融合蛋白定位于細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴

綜上所述，本研究對(duì)GIMAP2蛋白的亞細(xì)胞定位分析為我們后續(xù)探索GIMAP2蛋白功能及相應(yīng)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本文編號(hào)：3891872