目的:對免疫相關GTP結合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)進行亞細胞定位分析,為深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基礎。方法:使用國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫查詢獲取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息學在線分析工具對GIMAP2蛋白的跨膜結構、核定位信號(nuclear localization signal,NLS)、核輸出信號(nuclear export signal,NES)及亞細胞定位進行分析預測。采用PCR技術擴增GIMAP2基因片段,并插入至p QCXIP-mCherry-N1表達載體,用氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。測序正確的重組質粒p QCXIP-GIMAP2-mCherry經過提取、純化步驟后,與逆轉錄病毒包裝質粒VSVG、Gag/Pol在脂質體介導下共同轉入HEK293FT細胞中進行病毒包裝。轉染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌細胞系MDA-MB-436。使用免疫熒光染色方法檢測內、外...

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圖1GIMAP2蛋白生物信息學分析

根據(jù)pQCXIP-GIMAP2-mCherry表達載體的構建示意圖(圖2A)，以pBABE-GIMAP2-EGFP質粒為模板，GIMAP2-F、GIMAP2-R為引物擴增GIMAP2基因片段，其PCR產物大小為1033bp。DNA凝膠電泳結果顯示，與預期大小相符(圖2B)。....

圖2pQCXIP-GIMAP2-mCherry重組載體構建過程

圖1GIMAP2蛋白生物信息學分析2.3內源性、外源性GIMAP2蛋白在MDA-MB-436細胞內共定位

圖3內源性、外源性GIMAP2蛋白在MDA-MB-436細胞內共定位

將穩(wěn)定表達GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436細胞以1.0×105個/孔接種在含蓋玻片的12孔板內，37℃培養(yǎng)12h。經固定、透膜、封閉、兔抗人GIMAP2抗體免疫染色等步驟后，激光共聚焦顯微鏡下觀察GIMAP2蛋白的定位情況，結果顯示抗體標記的GIMAP....

圖4GIMAP2-mCherry融合蛋白定位于細胞中內質網(wǎng)和脂滴

綜上所述，本研究對GIMAP2蛋白的亞細胞定位分析為我們后續(xù)探索GIMAP2蛋白功能及相應機制提供了實驗基礎。

本文編號：3891872