腺病毒(Adenovirus,AdV)是常見的基因治療載體,已有的腺病毒下游純化工藝通常采取陰離子交換層析搭配分子篩的方式,該方法存在耗時長、成本高、難以放大并且所獲得的腺病毒中具有感染性的腺病毒比例較低的問題,本研究旨在探究并優(yōu)化一步層析法,純化得到高滴度的5型腺病毒。首先在5L生物反應器中利用HEK-293.2sus細胞擴增5型腺病毒,通過對細胞沉淀的反復凍融釋放病毒,利用過濾和超濾技術(shù)去除部分雜質(zhì),并通過添加核酸酶降低料液的黏稠度,最后利用新型復合填料Capto core 700或Fractogel填料進行純化。純化后的病毒利用50%組織細胞感染量(Median tissue culture infective dose,TCID50)測定方法測定病毒滴度,利用PCR-熒光探針法檢測宿主DNA的殘留以及酶聯(lián)免疫法檢測宿主蛋白的殘留以判斷除雜效果。兩種一步層析法純化腺病毒的回收率均高于傳統(tǒng)的兩步法,但在宿主蛋白和宿主DNA的去除效果上Capto core700的結(jié)果均不如Fractogel填料與超濾置換的結(jié)合,所以利用超濾和Fractogel結(jié)合的純化方式更適合獲得臨床級別的腺病毒...

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【文章目錄】：
材料與方法
    1細胞和病毒
    2材料和試劑
    3主要設(shè)備
    4細胞培養(yǎng)
    5病毒擴增和釋放
    6超濾置換
    7純化
    8 TCID50
結(jié)果
    1 300kD膜包超濾
    2Fractogel DEAE陰離子交換填料層析純化5型腺病毒
    3 Capto core700復合填料層析純化5型腺病毒
    4Q Sepharose XL和Sepharose 4 Fast Flow2步法層析純化5型腺病毒
討論



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