PZR（Protein zero related）即髓鞘P0蛋白相關(guān)蛋白,由MPZL1基因編碼,位于人常染色體1q24.1-24.2。PZR是一種高度保守的蛋白質(zhì),在多種細(xì)胞類型中均有表達(dá),作為SHP-2的特異性錨定蛋白和生理底物,很可能會在某些SHP-2參與的信號通路中發(fā)揮重要作用。研究表明,PZR會對細(xì)胞的遷移和粘附產(chǎn)生影響,而且在NS/LS、HCC BCa（HER2+）等疾病中都存在PZR的異常表達(dá)。但是PZR的生物學(xué)功能和臨床意義仍然不明確,還需進(jìn)行深入研究。本文基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1中MPZL1基因。首先根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設(shè)計原則,設(shè)計特異性識別MPZL1基因第二個外顯子相關(guān)序列的兩個sgRNA,再分別與PX458和PX459載體相連構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定后,將兩個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SPC-A1細(xì)胞中,用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲除MPZL1基因的細(xì)胞株。最后通過PCR、Western Blot和基因測序鑒定其基因型,實驗結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了MPZL1基因敲除的SPC-A1穩(wěn)定細(xì)胞株。此外,我們通過CCK-8、原位計數(shù)... 

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 PZR簡介
        1.1.1 PZR的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特征
        1.1.2 PZR的生物學(xué)功能
        1.1.3 PZR與疾病
    1.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)
        1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成
        1.2.2 CRISPR/Cas9作用原理
        1.2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用
    1.3 本課題的研究內(nèi)容及目的
第二章 MPZL1基因敲除SPC-A1穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要試劑與檢測試劑盒
        2.1.2 菌株、載體和細(xì)胞
        2.1.3 主要耗材與儀器設(shè)備
        2.1.4 主要溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細(xì)胞系的選擇
        2.2.2 sgRNA序列設(shè)計
        2.2.3 MPZL1-sgRNA雙鏈和線性PX458、PX459載體的構(gòu)建
        2.2.4 重組質(zhì)粒PX458-MPZL1-sgRNA1和PX459-MPZL1-sgRNA 2 的構(gòu)建及鑒定
        2.2.5 SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染
        2.2.6 穩(wěn)定細(xì)胞株的單克隆篩選
        2.2.7 Western Blot鑒定
        2.2.8 PCR及基因測序分析
    2.3 實驗結(jié)果及分析
        2.3.1 MPZL1基因編碼蛋白在不同細(xì)胞系中的相對表達(dá)水平
        2.3.2 PX458-MPZL1-sgRNA1和PX459-MPZL1-sgRNA2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 Western Blot鑒定SPC-A1-MPZL1-KO穩(wěn)定細(xì)胞株內(nèi)MPZL1編碼蛋白的表達(dá)
        2.3.4 SPC-A1-MPZL1-KO穩(wěn)定細(xì)胞株的PCR及基因測序鑒定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 MPZL1基因?qū)PC-A1細(xì)胞的影響
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要試劑與檢測試劑盒
        3.1.2 菌株、載體和細(xì)胞
        3.1.3 主要耗材與儀器設(shè)備
        3.1.4 主要溶液配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 CCK-8 細(xì)胞增殖實驗
        3.2.2 細(xì)胞原位計數(shù)實驗
        3.2.3 細(xì)胞劃痕實驗
        3.2.4 細(xì)胞懸滴聚集實驗
        3.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 CCK-8 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果
        3.3.2 細(xì)胞原位計數(shù)實驗結(jié)果
        3.3.3 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果
        3.3.4 細(xì)胞懸滴聚集實驗結(jié)果
    3.4 本章小結(jié)
討論
參考文獻(xiàn)
作者簡介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基因編輯技術(shù):進(jìn)展與挑戰(zhàn)[J]. 盧俊南,褚鑫,潘燕平,陳映羲,溫欒,戴俊彪.  中國科學(xué)院院刊. 2018(11)
[2]CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶效應(yīng)及優(yōu)化策略[J]. 郭全娟,韓秋菊,張建.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2018(08)
[3]利用CRISPR/Cas9n double nick系統(tǒng)構(gòu)建人DNAH2基因敲除的U2OS細(xì)胞株[J]. 常麗賢,孫聰聰,陳曉娟,楊文鈺,張家源,張英弛,袁衛(wèi)平,竺曉凡.  生物工程學(xué)報. 2017(02)
[4]CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 鄭武,谷峰.  遺傳. 2015(10)
[5]The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions[J]. QU CHENG KUI Department of Hematopoiesis, Jerome H. Holland Laboratory for the Biomedical Sciences, American Red Cross, Rockville, Department of Anatomy and Cell Biology, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, Washington DC.  Cell Research. 2000(04)



本文編號：3654824