發(fā)布時間：2021-10-11 19:43

　　目的原核表達(dá)、純化由人表皮生長因子受體3（HER3）183-227aa肽段（HER3Ⅰ）和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段（MVF）融合構(gòu)建的重組肽（MVF-HER3Ⅰ）,并制備其多克隆抗體。方法將MVF與HER3Ⅰ融合構(gòu)建重組肽MVF-HER3Ⅰ,用化學(xué)合成法合成重組肽基因,并將其與pET21b質(zhì)粒和含有硫氧還蛋白（Trx）基因的pET32a質(zhì)粒連接構(gòu)建重組肽表達(dá)質(zhì)粒,重組質(zhì)粒用雙酶切法鑒定。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）并進(jìn)行表達(dá)參數(shù)優(yōu)化及誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白依次經(jīng)鎳離子親和層析、腸激酶酶切和再次鎳離子親和層析制備重組肽。表達(dá)和純化過程中的樣品純度和相對分子質(zhì)量用SDS-PAGE分析。以純化的重組肽為抗原免疫大鼠制備多克隆抗體。用ELISA法測定抗重組肽多克隆抗體效價,免疫印跡和免疫沉淀法分析抗重組肽多克隆抗體對重組肽和非變性狀態(tài)HER3的識別,激光共聚焦法分析抗重組肽多克隆抗體與MCF7細(xì)胞的結(jié)合,磺酰羅丹明B染色法測定在有無神經(jīng)調(diào)節(jié)素刺激下抗重組肽多克隆抗體對高表達(dá)HER3的MCF7細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果成功構(gòu)建了重組肽的兩種表達(dá)質(zhì)粒,重組肽基因不能單獨(dú)表達(dá),但和... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pET21b-MVF-HER3Ⅰ和pET32a-MVF-HER3Ⅰ的雙酶切鑒定

隨機(jī)挑取的多株轉(zhuǎn)化了pET32a-MVF-HER3Ⅰ或PET21b-MVF-HER3Ⅰ的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，構(gòu)建于pET21b的MVF-HER3Ⅰ基因不能單獨(dú)表達(dá)，但和Trx融合后可見明顯的蛋白表達(dá)條帶（圖2）。融合蛋白TrxMVF-HER3Ⅰ相對分子質(zhì)量約為24 000和理論值一致。2.3 Trx-MVF-HER3Ⅰ誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

12%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，工程菌在培養(yǎng)溫度為37℃，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h時，對TrxMVF-HER3Ⅰ的表達(dá)量達(dá)峰值，約為20%（圖3）。據(jù)此確定工程菌在此條件下對Trx-MVF-HER3Ⅰ最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)時間為7 h。2.4 Trx-MVF-HER3ⅠIPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]奇異變形桿菌聚磷酸鹽激酶多克隆抗體的制備和鑒定[J]. 彭亮,區(qū)靜怡,潘嘉韻,鄧聰,陳景紅,曹虹.  南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2017(03)



本文編號：3431129