目的:鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci,Cps）是一種可引起人和禽類呼吸道感染的專性胞內(nèi)寄生菌。質(zhì)粒蛋白是衣原體重要的毒力因子,目前對(duì)其確切的致病機(jī)制研究較局限。本研究旨在探究Cps質(zhì)粒蛋白誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬及相關(guān)信號(hào)通路,為進(jìn)一步闡明Cps感染致病機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:將本課題組前期已經(jīng)構(gòu)建好的pET28a-CPSIT_p7重組菌接種至固體培養(yǎng)基中,選取陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng),經(jīng)Ni²⁺NTA親和層析柱純化蛋白,超濾管濃縮后獲得CPSIT_p7蛋白。經(jīng)親和層析去除內(nèi)毒素后,分別用濃度為0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的CPSIT_p7蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞18 h,以DPBS作為陰性對(duì)照,間接免疫熒光檢測(cè)LC3熒光斑點(diǎn),Western blot技術(shù)檢測(cè)LC3、Beclin1、SQSTM1/p62的蛋白表達(dá)水平。用CPSIT_p7（10μg/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞30 min、60 min、90 min、120 m... 

【文章來(lái)源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CPSIT_p7重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖

圖 4.2 重組蛋白 CPSIT_p7 純化 SDS-PAGE 圖4. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CPSIT_p7 purification. M:Marker, 1: theflow liquid; 2-5:10 mM, 20 mM, 40 mM and 100 mM imidazole concentration washing li:150 mM imidazole concentration washing liquid; 8-9: 250mM imidazole concentration e CPSIT_p7 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后的細(xì)胞毒性將RAW264.7細(xì)胞鋪板于96孔板內(nèi)，按照LDH試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)CPSI RAW264.7 細(xì)胞后的細(xì)胞毒性，得到如圖 4.3 的結(jié)果。LDH 檢測(cè)試劑 LDH 是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在胞漿內(nèi)含量豐富，正常情況下不能通過(guò)當(dāng)細(xì)胞受損傷或死亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外，此時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH 活性亡數(shù)目成正比，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH 的活性，判斷細(xì)胞的。圖 4.3 顯示，CPSIT_p7 各濃度刺激組相比與對(duì)照組 LDH 活性無(wú)明顯差

圖 4.3 在刺激 18h 后，監(jiān)測(cè) LDH 釋放（450 nm 處吸光度） After 18 hours post-stimulation, LDH release was monitored (absorbaT_p7 誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞自噬免疫熒光法檢測(cè) CPSIT_p7 刺激細(xì)胞后 LC3 的表 CPSIT_p7 刺激后是否會(huì)誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞發(fā)生自噬，測(cè) LC3 的熒光斑點(diǎn)。用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果，發(fā)，經(jīng) CPSIT_p7 刺激的實(shí)驗(yàn)組 LC3 熒光斑點(diǎn)明顯增加（CPSIT_p7 能誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞自噬。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白誘發(fā)小鼠生殖道免疫損傷初步研究[J]. 鄧紅玉,李忠玉,吳移謀,周輝,馬康康,陸春雪,鐘光明.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2013 (02)



本文編號(hào)：3316365