細菌對抗生素的耐藥性日趨增強使得多重耐藥菌株也在增多。作為院內(nèi)感染的主要致病菌之一,銅綠假單胞菌的耐藥菌株也頻繁出現(xiàn),這就使得現(xiàn)有的抗生素很難治愈這種細菌所引起的感染。運動性對于病原菌的定植以及出現(xiàn)耐藥的主要原因之一的生物被膜的形成非常重要。前期研究發(fā)現(xiàn),臨床中分離的蹭行運動能力減弱的菌株多表現(xiàn)為對羧芐青霉素耐藥,而部分與菌毛相關(guān)的基因突變后并未表現(xiàn)出抗生素抗性。因此本實驗基于上述研究,進一步探討菌體的蹭行運動與其對羧芐青霉素的耐藥性之間是否具有一定的相關(guān)性?本論文通過兩種方案進行研究:首先,構(gòu)建與菌毛相關(guān)基因以及調(diào)控基因的突變體,直接確定蹭行運動相關(guān)的菌毛編碼基因是否影響菌株對羧芐青霉素的抗性。其次,通過轉(zhuǎn)座突變體庫的構(gòu)建,篩選蹭行運動明顯降低且對羧芐青霉素敏感性發(fā)生變化的突變體,確定其是否是菌毛相關(guān)的基因。研究中選擇了pilPONM、pilQ、pilF、pilT、fimV、pilK、pilRS、cpdA等13個基因或操縱子進行敲除,通過測定相關(guān)表型以及透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):編碼菌毛的結(jié)構(gòu)基因cpdA對羧芐青霉素變得敏感,但是蹭行運動能力未發(fā)生顯著變化。其余菌毛相關(guān)基因突變后蹭行運... 

【文章來源】：西北大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表
第一章 緒論
    1.1 銅綠假單胞菌
        1.1.1 銅綠假單胞菌簡介
        1.1.2 銅綠假單胞菌的致病性
        1.1.3 銅綠假單胞菌的耐藥機制
        1.1.4 銅綠假單胞菌的Ⅳ菌毛與蹭行運動
    1.2 抗生素
        1.2.1 抗生素的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展
        1.2.2 抗生素的作用機理
        1.2.3 抗生素的使用現(xiàn)狀
    1.3 抗生素與運動性的研究進展
    1.4 本課題研究的內(nèi)容和目的及意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗所用菌株和質(zhì)粒以及引物列表
        2.1.2 實驗所用培養(yǎng)基、緩沖液的配制
        2.1.3 實驗所用試劑
        2.1.4 實驗所用儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質(zhì)粒DNA的小量提取
        2.2.2 質(zhì)粒和基因等的純化
        2.2.3 E.coli10B感受態(tài)細胞的制備
        2.2.4 目的基因片段的獲取
        2.2.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        2.2.6 酶切和連接反應(yīng)
        2.2.7 電轉(zhuǎn)化
        2.2.8 三親株實驗
        2.2.9 基因敲除
        2.2.10 隨機轉(zhuǎn)座突變體的構(gòu)建
        2.2.11 細菌的蹭行運動
        2.2.12 與細菌的蹭行運動相關(guān)的轉(zhuǎn)座突變體的篩選
        2.2.13 與細菌對羧芐青霉素的耐藥性相關(guān)的轉(zhuǎn)座突變體的篩選
        2.2.14 液體測定菌株對Cb的最小抑制濃度(MIC)
        2.2.15 隨機引物PCR
        2.2.16 隨機PCR過程以及轉(zhuǎn)座子插入位點的確定
        2.2.17 透射電子顯微鏡(TEM)觀察菌體Ⅳ菌毛
        2.2.18 細菌的泳動(swimming)與叢動(swarming)
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 與T4P有關(guān)的基因的突變體的檢測
        3.1.1 與Ⅳ菌毛相關(guān)的部分基因的缺失突變體的構(gòu)建
        3.1.2 T4P相關(guān)的基因缺失突變體的蹭行運動
        3.1.3 T4P相關(guān)基因的缺失突變體的Cb抗性表型
        3.1.4 T4P相關(guān)基因的缺失突變體對其它16 種抗生素或抗菌藥的抗性檢測
        3.1.5 透射電子顯微鏡(TEM)觀察T4P相關(guān)基因的突變體的形態(tài)
    3.2 隨機轉(zhuǎn)座突變體的研究
        3.2.1 與蹭行運動有關(guān)的隨機轉(zhuǎn)座突變體庫的構(gòu)建
        3.2.2 同時影響蹭行運動和羧芐青霉素的轉(zhuǎn)座突變體的篩選
        3.2.3 轉(zhuǎn)座突變體對其它16 種抗生素或抗菌藥的抗性檢測
        3.2.4 轉(zhuǎn)座子插入基因位點的確定
        3.2.5 PA5489和PA3145 以及PA5332 基因的相關(guān)信息
        3.2.6 dsbA和 wbpL以及crC基因缺失突變體的構(gòu)建
        3.2.7 ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC的蹭行運動
        3.2.8 ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC對 Cb及其它16 種抗生素或抗菌藥的抗性檢測
        3.2.9 透射電子顯微鏡(TEM)觀察ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC的形態(tài)
        3.2.10 與DsbA和 WbpL以及Crc有相互作用的蛋白的預(yù)測
        3.2.11 ΔdsbA和 ΔwbpL以及ΔcrC的泳動及叢動觀察
第四章 總結(jié)與討論
    4.1 銅綠假單胞菌Ⅳ菌毛相關(guān)基因的研究
    4.2 銅綠假單胞菌隨機轉(zhuǎn)座突變的研究
參考文獻
碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝



本文編號：3164734