目的探討siRNA抑制登革病毒復(fù)制的分子機(jī)制。方法用登革病毒感染Vero細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)Si-DENV的Vero細(xì)胞系上清中病毒含量,并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)感染細(xì)胞的比例,利用細(xì)胞免疫熒光法和Western blot方法檢測(cè)登革病毒蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 Si-DENV能夠抑制登革病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制以及病毒釋放,與對(duì)照組相比,感染后第3～7d,上清中病毒含量的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。感染后第7d,Si-DENV組登革病毒感染細(xì)胞的比例僅為4.48%,對(duì)照組感染細(xì)胞比例為81.06%。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR結(jié)果表明Si-DENV組病毒基因組RNA及負(fù)鏈RNA含量顯著減少,與Si-NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,細(xì)胞免疫熒光法和Western blot實(shí)驗(yàn)證明Si-DENV下調(diào)prM、E、NS1等病毒蛋白在Vero細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)論利用慢病毒轉(zhuǎn)染Si-DENV能抑制登革病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制,為登革病毒的防治提供了新的思路。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2020,15(04)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【部分圖文】：

細(xì)胞上清中登革病毒含量的變化

采用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析確定各組細(xì)胞的病毒感染比例。其中，共聚焦顯微鏡觀察顯示，在表達(dá)Si-DENV的細(xì)胞中DENV復(fù)制被顯著抑制，只有少數(shù)細(xì)胞被DENV感染，而DENV對(duì)照組及Si-NC對(duì)照組>90%的細(xì)胞均能檢測(cè)到登革病毒prM蛋白（圖2A）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，Si-DENV組eGFP+/prM+細(xì)胞占4.48%,Si-NC組eGFP+/prM+細(xì)胞占81.06%，無(wú)siRNA組的eGFP-/prM+細(xì)胞占87.52%（圖2B）。表明Si-DENV具有抑制登革病毒感染Vero細(xì)胞作用，即能抑制登革病毒的復(fù)制和釋放。3 Si-DENV抑制DENV-1基因組RNA復(fù)制和負(fù)鏈RNA合成作用

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR或定性PCR檢測(cè)細(xì)胞中DENV-1基因組RNA和負(fù)鏈RNA的相對(duì)含量。用特異性引物分別擴(kuò)增病毒基因組RNA及負(fù)鏈RNA，并以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)。病毒RNA的相對(duì)含量見(jiàn)圖3,Si-DENV組病毒基因組RNA及負(fù)鏈RNA相對(duì)含量分別為0.016±0.008、0.011±0.027,Si-NC組分別為1.165±0.017、1.129±0.073。SiDENV組與Si-NC組相比，病毒RNA相對(duì)含量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），病毒基因組RNA及負(fù)鏈RNA的拷貝數(shù)均下降>95%,Si-NC組的RNA的拷貝數(shù)與DENV組的拷貝數(shù)相當(dāng)。1%瓊脂糖凝膠電泳同樣證實(shí)，與其他組相比Si-DENV組病毒RNA合成顯著減少。表明Si-DENV能抑制DENV-1基因組RNA和負(fù)鏈RNA的合成。4 Si-DENV對(duì)登革病毒蛋白表達(dá)的抑制作用

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]表達(dá)登革病毒prM基因小干擾RNA的Vero細(xì)胞系的建立[J]. 李磊,吳新偉,伍業(yè)健,羅蘭,蔣力云,楊霞.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2011(11)



本文編號(hào)：3127828