本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌體內(nèi)和體外表達(dá)HIV-1 gp41重組抗原及其免疫反應(yīng)性檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來(lái),HIV病毒在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)快速流行態(tài)勢(shì)。HIV抗體診斷試劑作為目前初步診斷HIV的主要方法,具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程的手段,制備具有良好免疫反應(yīng)性的HIV-1 gp41重組抗原原料,對(duì)于HIV抗體診斷試劑的研發(fā)有著深遠(yuǎn)意義。本文首先合成了經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的gp41基因質(zhì)粒模板pET-28a(+)-gp41,PCR擴(kuò)增獲得了包含gp41主要優(yōu)勢(shì)抗原表位以及膜外重要結(jié)構(gòu)域(NHR、CHR、 MPER)的截短基因序列。通過(guò)在gp41截短片段上游添加親水性分子伴侶DsbA,在大腸桿菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了gp41優(yōu)勢(shì)抗原表位蛋白的融合表達(dá)。在優(yōu)化表達(dá)條件下(37℃,0.2 mM IPTG,誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間10 h),融合蛋白表達(dá)水平為8.7 μg/mL鑒于gp41融合蛋白在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)的水平較低,無(wú)法滿(mǎn)足制備gp41抗原的要求,本研究進(jìn)而利用大腸桿菌體外無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全長(zhǎng)基因,成功構(gòu)建無(wú)細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒pIVEX2.4c-gp41,在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞體系中實(shí)現(xiàn)了gp41全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步考察去污劑重懸目標(biāo)蛋白和直接在無(wú)細(xì)胞體系中添加去污劑兩種模式對(duì)獲得可溶gp41蛋白的影響。結(jié)果顯示,所嘗試的各種去污劑均不能有效重懸gp41蛋白沉淀；而直接添加去污劑模式在最優(yōu)條件下(添加終濃度為0.2%的Brij78),可溶gp41蛋白的表達(dá)水平達(dá)到650μg/mL。對(duì)添加去污劑模式所表達(dá)的可溶gp41重組蛋白進(jìn)行純化、濃縮和替換緩沖液,蛋白純度達(dá)到95.6%,濃度為1.5 mg/mL,總回收率為70%。利用純化后的gp41重組蛋白制備乳膠法免疫層析試紙,通過(guò)對(duì)不同抗體滴度HIV-1陽(yáng)性標(biāo)本、HIV-1陰性標(biāo)本、TP陽(yáng)性標(biāo)本以及HBeAb陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè),證明該gp41重組蛋白免疫反應(yīng)性良好。總之,本文致力于HIV-1 gp41在大腸桿菌體內(nèi)和體外無(wú)細(xì)胞體系的重組表達(dá)研究。通過(guò)對(duì)無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了gp41的全長(zhǎng)可溶表達(dá),親和純化獲得的目標(biāo)蛋白經(jīng)乳膠法試紙?jiān)u估具有免疫反應(yīng)性。本研究為HIV抗體診斷試劑的研發(fā)提供了具有潛在應(yīng)用價(jià)值的gp41抗原。
【關(guān)鍵詞】：人類(lèi)免疫缺陷病毒 跨膜蛋白gp41 融合表達(dá) 無(wú)細(xì)胞體系 去污劑 乳膠法試紙 免疫反應(yīng)性
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-15
• 第一章 緒論15-35
• 1.1 引言15
• 1.2 人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV15-25
• 1.2.1 HIV的發(fā)現(xiàn)15-17
• 1.2.2 HIV的形態(tài)結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2.3 HIV的基因組結(jié)構(gòu)18-20
• 1.2.4 HIV入侵細(xì)胞的機(jī)制和致病機(jī)理20-21
• 1.2.5 HIV的分型及分布21-23
• 1.2.6 全球艾滋病流行現(xiàn)狀23-25
• 1.3 HIV-1跨膜蛋白gp4125-29
• 1.3.1 HIV-1 gp41的結(jié)構(gòu)和功能25-27
• 1.3.2 HIV-1 gp41的抗原表位27-28
• 1.3.3 gp41在HIV診斷檢測(cè)中的應(yīng)用28-29
• 1.4 膜蛋白表達(dá)研究的策略29-33
• 1.4.1 體內(nèi)融合表達(dá)策略30
• 1.4.2 體外無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)策略30-33
• 1.5 本課題的基本思路和研究?jī)?nèi)容33-35
• 第二章 材料與方法35-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料35-38
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株35
• 2.1.2 質(zhì)粒35
• 2.1.3 主要試劑及工具酶35-36
• 2.1.4 培養(yǎng)基36
• 2.1.5 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)溶液配制36-37
• 2.1.6 主要儀器37-38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法38-43
• 2.2.1 分子克隆實(shí)驗(yàn)38-40
• 2.2.2 細(xì)胞密度的測(cè)定40
• 2.2.3 SDS-PAGE電泳40
• 2.2.4 Western blotting分析40-41
• 2.2.5 大腸桿菌無(wú)細(xì)胞體系抽提物的制備41-43
• 第三章 HIV-1 gp41在大腸桿菌體內(nèi)的截短融合表達(dá)43-55
• 3.1 引言43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料44
• 3.2.1 菌株與質(zhì)粒44
• 3.2.2 試劑及工具酶44
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法44-48
• 3.3.1 模板合成及目的基因選擇44-45
• 3.3.2 引物設(shè)計(jì)45-46
• 3.3.3 PCR擴(kuò)增目的基因46
• 3.3.4 融合表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 3.3.5 大腸桿菌體系誘導(dǎo)表達(dá)gp41融合蛋白47
• 3.3.6 細(xì)胞破碎47
• 3.3.7 SDS-PAGE與Western blotting47-48
• 3.4 結(jié)果與討論48-54
• 3.4.1 gp41截短基因的擴(kuò)增48
• 3.4.2 pET-39b(+)-gp41-T融合表達(dá)載體的構(gòu)建48-49
• 3.4.3 gp41融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)49-51
• 3.4.4 誘導(dǎo)溫度對(duì)gp41融合蛋白表達(dá)的影響51-52
• 3.4.5 IPTG濃度對(duì)gp41融合蛋白表達(dá)的影響52-53
• 3.4.6 誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)gp41融合蛋白表達(dá)的影響53-54
• 3.5 本章小結(jié)54-55
• 第四章 HIV-1 gp41在大腸桿菌體外無(wú)細(xì)胞體系的高效表達(dá)55-71
• 4.1 引言55
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料55-56
• 4.2.1 菌株與質(zhì)粒55-56
• 4.2.2 試劑及工具酶56
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法56-60
• 4.3.1 引物設(shè)計(jì)56
• 4.3.2 目的基因的克隆56
• 4.3.3 無(wú)細(xì)胞重組表達(dá)載體的構(gòu)建56-57
• 4.3.4 制備大腸桿菌無(wú)細(xì)胞體系抽提物57
• 4.3.5 大腸桿菌無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系配置57-59
• 4.3.6 無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)gp4159
• 4.3.7 去污劑重懸無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)的膜蛋白沉淀(P-CF模式)59
• 4.3.8 無(wú)細(xì)胞體系添加去污劑可溶表達(dá)gp41(D-CF模式)59-60
• 4.3.9 SDS-PAGE60
• 4.4 結(jié)果與討論60-69
• 4.4.1 gp41全長(zhǎng)基因的克隆60-61
• 4.4.2 pIVEX2.4c-gp41無(wú)細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建61-62
• 4.4.3 gp41蛋白的無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)62-63
• 4.4.4 去污劑重懸表達(dá)可溶性gp4163-64
• 4.4.5 直接在無(wú)細(xì)胞體系添加去污劑表達(dá)可溶性gp4164-66
• 4.4.6 Brij78濃度對(duì)無(wú)細(xì)胞體系可溶性表達(dá)gp41的影響66-67
• 4.4.7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)無(wú)細(xì)胞體系可溶表達(dá)gp41的影響67-68
• 4.4.8 無(wú)細(xì)胞體系兩種表達(dá)可溶性gp41模式的比較68-69
• 4.5 本章小結(jié)69-71
• 第五章 gp41重組蛋白的分離純化及其免疫反應(yīng)性的初步檢測(cè)71-81
• 5.1 引言71-72
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料72
• 5.2.1 質(zhì)粒72
• 5.2.2 試劑72
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法72-75
• 5.3.1 可溶性gp41的制備表達(dá)72
• 5.3.2 Ni-NTA親和層析純化gp4172-73
• 5.3.3 純化后蛋白的濃縮和緩沖液替換73-74
• 5.3.4 蛋白濃度的測(cè)定74
• 5.3.5 SDS-PAGE74
• 5.3.6 乳膠法試紙的制備74
• 5.3.7 gp41重組蛋白的反應(yīng)性檢測(cè)74
• 5.3.8 gp41重組蛋白的靈敏度檢測(cè)74-75
• 5.3.9 gp41重組蛋白的特異性檢測(cè)75
• 5.4 結(jié)果與討論75-79
• 5.4.1 gp41重組蛋白的純化75-76
• 5.4.2 gp41重組蛋白的濃縮和替換緩沖液76
• 5.4.3 gp41重組蛋白的反應(yīng)性檢測(cè)76-77
• 5.4.4 gp41重組蛋白的靈敏度檢測(cè)77-78
• 5.4.5 gp41重組蛋白的特異性檢測(cè)78-79
• 5.5 本章小結(jié)79-81
• 第六章 結(jié)論與展望81-85
• 6.1 結(jié)論81-82
• 6.2 展望82-85
• 參考文獻(xiàn)85-99
• 作者簡(jiǎn)介99

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