本文關(guān)鍵詞：B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究相關(guān)單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae, Hi)是一類可以引起嬰幼兒呼吸道感染進(jìn)而會(huì)引起繼發(fā)性疾病的病原菌。根據(jù)其有無(wú)莢膜,可分為有莢膜型和無(wú)莢膜型。無(wú)莢膜型細(xì)菌通常引起成人和兒童的局部感染；有莢膜型細(xì)菌可以引起較為嚴(yán)重的侵襲性感染。根據(jù)其細(xì)菌表面莢膜多糖的成分和抗原性的不同,有莢膜型細(xì)菌又可以分為a、b、c、d、e、f六種血清型,不能分型者稱為不定型型。其中,B型流感嗜血桿菌(Hib)的致病力最強(qiáng),它可以引起敗血癥,并由此引發(fā)腦膜炎、肺炎、會(huì)厭炎、蜂窩組織炎、心包炎和中耳炎等。Hib的感染對(duì)象主要是5歲以下的小兒,尤其是2歲以下的嬰幼兒。目前,對(duì)于Hib感染的主要治療是依靠抗生素。然而,近年來(lái)隨著細(xì)菌耐藥性的增加,特別是多重耐藥性菌株的出現(xiàn),采用疫苗預(yù)防Hib變得十分必要,因此該策略受到越來(lái)越多的重視。如今已有多種疫苗用于Hib的預(yù)防并且成效顯著,但它們也存在一定的缺點(diǎn),譬如價(jià)格昂貴且疫苗的質(zhì)量和安全性難以控制等。與此同時(shí),能夠?qū)ib感染進(jìn)行早期檢測(cè),以便給予及時(shí)的處理,對(duì)于實(shí)施有效的治療、防止Hib的擴(kuò)散及降低由感染引發(fā)的后遺癥都是非常必要和有重要意義的,但是目前還缺乏特別有效的Hib檢測(cè)方法。古巴科學(xué)家采用化學(xué)合成的方法制備獲得了Hib細(xì)菌莢膜多糖的寡糖片段,并成功地將其應(yīng)用研制新型的半合成Hib疫苗,證實(shí)具有良好的免疫效果,該疫苗已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。這一研究表明了化學(xué)方法制備的具有單一結(jié)構(gòu)、質(zhì)量明確、安全性優(yōu)良的寡糖抗原用于研發(fā)疫苗的可能性。此外,隨著單克隆抗體技術(shù)的不斷成熟及其在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,如今以此技術(shù)為基礎(chǔ)研發(fā)特異、高效的單克隆抗體檢測(cè)試劑這一領(lǐng)域得到飛速發(fā)展,這為我們發(fā)展可以實(shí)現(xiàn)Hib感染早期檢測(cè)的單克隆抗體試劑盒提供了可能。本課題的終極目標(biāo)是研發(fā)針對(duì)Hib的新型糖疫苗,同時(shí)研發(fā)可用于Hib細(xì)菌診斷的單克隆抗體。為此,本課題組先后合成了以Hib的細(xì)菌莢膜多糖,即多聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)的重復(fù)片段為基礎(chǔ)的七(Hept).九(Nona)和十一(Undeca)聚糖,并將它們與作為載體蛋白的血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶合,形成糖蛋白結(jié)合疫苗Hept-KLH、Nona-KLH和Undeca-KLH。本論文對(duì)這些糖蛋白結(jié)合疫苗進(jìn)行了全面的免疫學(xué)評(píng)價(jià),并檢測(cè)了其抗血清與Hib10211菌株的結(jié)合力。同時(shí),還用這些糖蛋白結(jié)合疫苗免疫小鼠,通過(guò)單克隆抗體技術(shù)制備獲得了針對(duì)Hib表面莢膜寡聚糖的單克隆抗體,鑒定了該單克隆抗體的亞型,并在體外檢測(cè)了單克隆抗體識(shí)別和殺傷Hib細(xì)菌的能力。試驗(yàn)結(jié)果表明,合成的三種糖綴合物中,Nona-KLH的免疫效果較其它兩種糖綴合物強(qiáng),經(jīng)過(guò)四次免疫之后,小鼠產(chǎn)生了很高的抗體滴度,特別是具有保護(hù)作用的IgG1免疫球蛋白,以及T細(xì)胞依賴型的免疫反應(yīng)�？寡迮cHib細(xì)菌的結(jié)合試驗(yàn)顯示,抗血清可以與Hib10211細(xì)菌進(jìn)行特異性結(jié)合。用Nona-KLH對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后,通過(guò)單克隆抗體技術(shù)制備獲得了一種抗原特異性的單克隆抗體,對(duì)其進(jìn)行抗體亞型分析以及SDS-PAGE、Western blot等分析的結(jié)果均顯示該抗體為IgM亞型。體外殺菌實(shí)驗(yàn)表明,在補(bǔ)體存在的條件下,該單克隆抗體可以介導(dǎo)明顯的補(bǔ)體依賴型“殺菌”效果。本研究證實(shí)了合成的多聚核糖基核糖醇磷酸酯重復(fù)片段的寡聚體與載體蛋白所形成的綴合物可以誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng),從而為研發(fā)新型的Hib糖疫苗提供了思路與方法；同時(shí),所獲得的可有效識(shí)別Hib細(xì)菌的單克隆抗體有可能為Hib感染的早期診斷提供新的手段。
【關(guān)鍵詞】：B型流感嗜血桿菌 合成疫苗 免疫反應(yīng) 單克隆抗體 殺菌能力
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 符號(hào)說(shuō)明11-13
• 第一章 緒論13-26
• 1.1 糖13-14
• 1.2 糖藥物14-15
• 1.3 糖疫苗15-16
• 1.4 糖疫苗的免疫機(jī)理16-17
• 1.5 Hib病原學(xué)17-18
• 1.6 Hib流行病學(xué)特點(diǎn)18-19
• 1.7 Hib疫苗的發(fā)展19-21
• 1.7.1 Hib莢膜多糖疫苗19-20
• 1.7.2 Hib結(jié)合疫苗20-21
• 1.7.2.1 PRP-D結(jié)合疫苗20
• 1.7.2.2 Hb-OC結(jié)合疫苗20-21
• 1.7.2.3 PRP-OMP結(jié)合疫苗21
• 1.7.2.4 PRP-T結(jié)合疫苗21
• 1.8 其他Hib疫苗的發(fā)展21-22
• 1.9 單克隆抗體技術(shù)22-23
• 1.10 單克隆抗體的應(yīng)用23-24
• 1.11 本研究的目的和意義24-26
• 第二章 半合成Hib糖結(jié)合疫苗的免疫學(xué)評(píng)價(jià)26-40
• 2.1 引言26-27
• 2.2 材料27-30
• 2.2.1 細(xì)菌菌株,疫苗,小鼠27
• 2.2.2 主要試劑以及耗材27
• 2.2.3 主要儀器27-28
• 2.2.4 主要試劑的配制28-30
• 2.2.4.1 Elisa相關(guān)試劑的配制28-29
• 2.2.4.2 Hib細(xì)菌培養(yǎng)的相關(guān)試劑29-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 2.3.1 流感嗜血桿菌糖蛋白疫苗的合成30
• 2.3.2 動(dòng)物免疫30
• 2.3.3 Elisa法檢測(cè)血清中抗體滴度30-31
• 2.3.4 Hib細(xì)菌的培養(yǎng)31
• 2.3.5 Hib細(xì)菌的鑒定31-32
• 2.3.5.1 革蘭氏染色31-32
• 2.3.5.2 生化檢定32
• 2.3.5.3 生長(zhǎng)因子檢定32
• 2.3.6 Hib細(xì)菌菌庫(kù)的建立32
• 2.3.7 Hib生長(zhǎng)曲線的測(cè)定32-33
• 2.3.8 抗血清與細(xì)菌的結(jié)合能力檢測(cè)33
• 2.4 結(jié)果與討論33-38
• 2.4.1 疫苗的免疫效果33-34
• 2.4.2 Hib細(xì)菌的培養(yǎng)結(jié)果34-35
• 2.4.3 Hib細(xì)菌的鑒定35-37
• 2.4.3.1 革蘭氏染色結(jié)果35-36
• 2.4.3.2 生化檢定結(jié)果36
• 2.4.3.3 生長(zhǎng)因子檢定實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.4.3.4 Hib細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定37
• 2.4.4 抗血清與細(xì)菌的結(jié)合實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.5 小結(jié)38-40
• 第三章 單克隆抗體的制備以及體外殺菌活性研究40-60
• 3.1 引言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料40-43
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物40
• 3.2.2 試驗(yàn)試劑及耗材40-41
• 3.2.3 主要儀器及其型號(hào)41
• 3.2.4 主要試劑的配制41-43
• 3.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑的配制41
• 3.2.4.2 SDS-PAGE緩沖液41-43
• 3.2.4.3 Western blot相關(guān)試劑配制43
• 3.2.4.4 多聚賴氨酸溶液配制43
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法43-51
• 3.3.1 小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)43-45
• 3.3.1.1 細(xì)胞的凍存43-44
• 3.3.1.2 細(xì)胞復(fù)蘇44
• 3.3.1.3 細(xì)胞傳代44
• 3.3.1.4 細(xì)胞收集與計(jì)數(shù)44-45
• 3.3.2 單克隆抗體的制備45-47
• 3.3.2.1 加強(qiáng)免疫45
• 3.3.2.2 脾細(xì)胞的制備45
• 3.3.2.3 小鼠骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備45-46
• 3.3.2.4 細(xì)胞融合46
• 3.3.2.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選46-47
• 3.3.2.6 雜交瘤細(xì)胞的克隆化47
• 3.3.3 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析47-48
• 3.3.4 單克隆抗體分型試劑盒檢測(cè)所得單克隆抗體的亞型48
• 3.3.4.1 樣品準(zhǔn)備與處理48
• 3.3.4.2 抗體分型檢測(cè)48
• 3.3.5 單克隆抗體的大量制備48-49
• 3.3.6 單克隆抗體抗體亞型的驗(yàn)證49-50
• 3.3.6.1 SDS-PAGE檢測(cè)49
• 3.3.6.2 Western blot49-50
• 3.3.7 單克隆抗體的“殺菌力”實(shí)驗(yàn)50-51
• 3.3.7.1 細(xì)菌菌落形成單位(CFU)的確定50
• 3.3.7.2 腹水中IgM“殺菌”力實(shí)驗(yàn)50-51
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論51-59
• 3.4.1 制備單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-52
• 3.4.2 雜交瘤細(xì)胞染色體分析結(jié)果52-53
• 3.4.3 單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果53-54
• 3.4.4 大量制備單克隆抗體結(jié)果54
• 3.4.5 單克隆抗體抗體亞型的驗(yàn)證結(jié)果54-59
• 3.4.5.1 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-55
• 3.4.5.2 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-57
• 3.4.5.3 細(xì)菌菌落形成單位(CFU)的確定57
• 3.4.5.4 腹水中IgM抗體的“殺菌”活性57-59
• 3.5 小結(jié)59-60
• 全文總結(jié)60-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)位論文68-69
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鐘細(xì)茍,段載金,康治雄;豬瘟單克隆抗體診斷技術(shù)的推廣應(yīng)用[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;1999年12期

  本文關(guān)鍵詞：B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究相關(guān)單克隆抗體的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：270593