本文關(guān)鍵詞：miR-34a通過調(diào)控N-myc表達抑制MDSCs凋亡的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：microRNAs (miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其大小長約20～25個核苷酸。近年來研究表明miRNAs在生物學(xué)的各個過程中發(fā)揮了極其重要的作用：如細胞和個體發(fā)育、器官形成、造血生成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝、細菌與病毒的感染和機體防御、炎癥的發(fā)生發(fā)展等。同樣,microRNAs在免疫系統(tǒng)中亦有很好的研究。已有的研究表明microRNAs在T細胞、B細胞、DC、NK細胞分化發(fā)育中均發(fā)揮重要作用,從而參與了機體先天免疫和獲得性免疫應(yīng)答。Rafael Casellas實驗室的研究結(jié)果表明niR-34a在各種免疫細胞中呈現(xiàn)出不同的表達水平,由此我們推測miR-34a可能在淋巴細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為進一步探討miR-34a在淋巴細胞分化發(fā)育中的作用,在本課題中,我們主要通過建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型并應(yīng)用這兩種動物模型來探討miR-34a在淋巴細胞分化發(fā)育中的作用。首先,我們構(gòu)建了miR-34a過表達質(zhì)粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a,并通過qPCR、流式分析等驗證了miR-34a過表達質(zhì)粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a的成功表達,在此基礎(chǔ)上,我們一方面制備了miR-34a的逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染小鼠的骨髓干細胞,建立了miR-34a的嵌合小鼠模型,通過PCR及FACS驗證了小鼠模型的成功構(gòu)建；另一方面,我們將pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a用Hind Ⅲ酶切線性化,經(jīng)顯微注射到受精卵細胞中制備了miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型。經(jīng)FACS分析發(fā)現(xiàn)：無論在嵌合小鼠中,還是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,過表達了miR-34a后,無論是在骨髓還是在脾臟中,B細胞的數(shù)目均有顯著減少,此結(jié)果與Baltimore實驗室研究結(jié)果一致,進一步說明了嵌合小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建成功。進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-34a后,無論是在嵌合模型還是在轉(zhuǎn)基因模型中,髓系來源的抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)都顯著高于其在正常小鼠體內(nèi)的比例,且在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)MDSCs的絕對數(shù)升高。通過BrdU染色研究發(fā)現(xiàn)BM和脾臟中BrdU陽性細胞比例未見顯著差異,這一結(jié)果提示miR-34a并不影響MDSCs細胞的自我更新或增殖。進一步分析MDPs等早期分化祖細胞發(fā)現(xiàn)：和WT小鼠比較,MDPs, GMPs等祖細胞比例未發(fā)現(xiàn)有顯著差異,但用Annexin Ⅴ染色,經(jīng)FACS檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因小鼠的MDSCs的凋亡明顯減少,這提示著miR-34a很可能是通過減少MDSCs的凋亡而使其百分比和絕對數(shù)增高。為進一步分析miR-34a抑制MDSCs凋亡的作用機制,尋找1niR-34a在MDSCs中的靶基因,我們應(yīng)用miRWalk軟件預(yù)測、熒光素酶報告系統(tǒng)檢測以及實時定量PCR及Western-blot等研究發(fā)現(xiàn), miR-34a可能通過作用于N-myc等來調(diào)控MDSCs的發(fā)育。為進一步探討miR-34a是否影響MDSCs的功能,我們應(yīng)用流式細胞儀分選MDSCs,并應(yīng)用實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)：和WT MDSCs相比,脾臟中niR-34a過表達的MDSCs產(chǎn)生高水平的TNF、iNOS、IL-17,而Arg、TGF-β的表達較低。但在BM MDSCs中miR-34a過表達后TNF、iNOS、IL-6、IL-10、IL-12等表達較高。為驗證這種細胞因子表達譜的變化是否影響MDSCs的功能,我們分別在miR-34a和WT小鼠中建立LLC小鼠模型,發(fā)現(xiàn)兩組腫瘤生長并無顯著差異�？紤]到miR-34a同樣在其他細胞中過表達,為排除其他細胞的影響,我們從miR-34a轉(zhuǎn)基因模型中純化BM MDSCs并在腫瘤注射前通過眼靜脈方式注射到小鼠體內(nèi),和WT MDSCs輸注組相比,miR-34a MDSCs并未顯著影響LLC腫瘤在體內(nèi)的生長。這些結(jié)果提示盡管miR-34a改變了MDSCs細胞因子的表達譜,但并未影響MDSCs對腫瘤生長的影響�？偨Y(jié)我們現(xiàn)有研究,我們成功建立了miR-34a過表達嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型,通過研究發(fā)現(xiàn),miR-34a通過抑制N-myc等分子的表達從而抑制了MDSCs的凋亡,盡管miR-34a過表達后影響了MDSCs的細胞因子的表達譜,但并不影響MDSCs對腫瘤的生長。這一系列的研究一方面揭示了miR-34a對MDSCs分化發(fā)育及凋亡等的影響,同時,也為microRNAs在淋巴細胞的生物學(xué)行為影響提供新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：miRNAs miR-34a 嵌合小鼠 轉(zhuǎn)基因小鼠 MDSC 發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-14
• 第一部分 miR-34a小鼠表型的分析14-32
• 材料和方法14-17
• 一、實驗材料14-15
• 二、實驗方法15-17
• 實驗結(jié)果17-30
• 一、miR-34a過表達骨髓嵌合小鼠模型的表型分析17-19
• 二、miR-34a過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型的表型分析19-24
• 三、miR-34a對淋巴細胞的增殖及凋亡的影響24-28
• 四、miR-34a對CMP、GMP發(fā)育的影響28-30
• 討論30-32
• 第二部分 miR-34a的靶基因分析及驗證32-49
• 材料和方法32-40
• 一、實驗材料32-34
• 二、實驗方法34-40
• 實驗結(jié)果40-47
• 一、miR-34a靶基因的生物學(xué)預(yù)測40-41
• 二、miR-34a報告質(zhì)粒的構(gòu)建41-45
• 三、N-myc是否是miR-34a在MDSCs發(fā)育過程中靶基因的驗證45-47
• 討論47-49
• 第三部分 miR-34a對MDSCs功能的研究49-58
• 材料和方法50-53
• 一、實驗材料50
• 二、實驗方法50-53
• 實驗結(jié)果53-56
• 討論56-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻60-63
• 綜述63-86
• 參考文獻76-86
• 碩士期間完成的論文86-87
• 附錄87-90
• 致謝90

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本文編號：268739