發(fā)布時(shí)間：2017-03-26 11:17

  本文關(guān)鍵詞：miR-34a通過(guò)調(diào)控N-myc表達(dá)抑制MDSCs凋亡的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：microRNAs (miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其大小長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸。近年來(lái)研究表明miRNAs在生物學(xué)的各個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用：如細(xì)胞和個(gè)體發(fā)育、器官形成、造血生成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝、細(xì)菌與病毒的感染和機(jī)體防御、炎癥的發(fā)生發(fā)展等。同樣,microRNAs在免疫系統(tǒng)中亦有很好的研究。已有的研究表明microRNAs在T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC、NK細(xì)胞分化發(fā)育中均發(fā)揮重要作用,從而參與了機(jī)體先天免疫和獲得性免疫應(yīng)答。Rafael Casellas實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明niR-34a在各種免疫細(xì)胞中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平,由此我們推測(cè)miR-34a可能在淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探討miR-34a在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育中的作用,在本課題中,我們主要通過(guò)建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型并應(yīng)用這兩種動(dòng)物模型來(lái)探討miR-34a在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育中的作用。首先,我們構(gòu)建了miR-34a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a,并通過(guò)qPCR、流式分析等驗(yàn)證了miR-34a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a的成功表達(dá),在此基礎(chǔ)上,我們一方面制備了miR-34a的逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染小鼠的骨髓干細(xì)胞,建立了miR-34a的嵌合小鼠模型,通過(guò)PCR及FACS驗(yàn)證了小鼠模型的成功構(gòu)建；另一方面,我們將pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a用Hind Ⅲ酶切線性化,經(jīng)顯微注射到受精卵細(xì)胞中制備了miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型。經(jīng)FACS分析發(fā)現(xiàn)：無(wú)論在嵌合小鼠中,還是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,過(guò)表達(dá)了miR-34a后,無(wú)論是在骨髓還是在脾臟中,B細(xì)胞的數(shù)目均有顯著減少,此結(jié)果與Baltimore實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果一致,進(jìn)一步說(shuō)明了嵌合小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建成功。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-34a后,無(wú)論是在嵌合模型還是在轉(zhuǎn)基因模型中,髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)都顯著高于其在正常小鼠體內(nèi)的比例,且在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)MDSCs的絕對(duì)數(shù)升高。通過(guò)BrdU染色研究發(fā)現(xiàn)BM和脾臟中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞比例未見(jiàn)顯著差異,這一結(jié)果提示miR-34a并不影響MDSCs細(xì)胞的自我更新或增殖。進(jìn)一步分析MDPs等早期分化祖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：和WT小鼠比較,MDPs, GMPs等祖細(xì)胞比例未發(fā)現(xiàn)有顯著差異,但用Annexin Ⅴ染色,經(jīng)FACS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因小鼠的MDSCs的凋亡明顯減少,這提示著miR-34a很可能是通過(guò)減少M(fèi)DSCs的凋亡而使其百分比和絕對(duì)數(shù)增高。為進(jìn)一步分析miR-34a抑制MDSCs凋亡的作用機(jī)制,尋找1niR-34a在MDSCs中的靶基因,我們應(yīng)用miRWalk軟件預(yù)測(cè)、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)以及實(shí)時(shí)定量PCR及Western-blot等研究發(fā)現(xiàn), miR-34a可能通過(guò)作用于N-myc等來(lái)調(diào)控MDSCs的發(fā)育。為進(jìn)一步探討miR-34a是否影響MDSCs的功能,我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選MDSCs,并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：和WT MDSCs相比,脾臟中niR-34a過(guò)表達(dá)的MDSCs產(chǎn)生高水平的TNF、iNOS、IL-17,而Arg、TGF-β的表達(dá)較低。但在BM MDSCs中miR-34a過(guò)表達(dá)后TNF、iNOS、IL-6、IL-10、IL-12等表達(dá)較高。為驗(yàn)證這種細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化是否影響MDSCs的功能,我們分別在miR-34a和WT小鼠中建立LLC小鼠模型,發(fā)現(xiàn)兩組腫瘤生長(zhǎng)并無(wú)顯著差異�？紤]到miR-34a同樣在其他細(xì)胞中過(guò)表達(dá),為排除其他細(xì)胞的影響,我們從miR-34a轉(zhuǎn)基因模型中純化BM MDSCs并在腫瘤注射前通過(guò)眼靜脈方式注射到小鼠體內(nèi),和WT MDSCs輸注組相比,miR-34a MDSCs并未顯著影響LLC腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。這些結(jié)果提示盡管miR-34a改變了MDSCs細(xì)胞因子的表達(dá)譜,但并未影響MDSCs對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響�？偨Y(jié)我們現(xiàn)有研究,我們成功建立了miR-34a過(guò)表達(dá)嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型,通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),miR-34a通過(guò)抑制N-myc等分子的表達(dá)從而抑制了MDSCs的凋亡,盡管miR-34a過(guò)表達(dá)后影響了MDSCs的細(xì)胞因子的表達(dá)譜,但并不影響MDSCs對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)。這一系列的研究一方面揭示了miR-34a對(duì)MDSCs分化發(fā)育及凋亡等的影響,同時(shí),也為microRNAs在淋巴細(xì)胞的生物學(xué)行為影響提供新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：miRNAs miR-34a 嵌合小鼠 轉(zhuǎn)基因小鼠 MDSC 發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-14
• 第一部分 miR-34a小鼠表型的分析14-32
• 材料和方法14-17
• 一、實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 二、實(shí)驗(yàn)方法15-17
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-30
• 一、miR-34a過(guò)表達(dá)骨髓嵌合小鼠模型的表型分析17-19
• 二、miR-34a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的表型分析19-24
• 三、miR-34a對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖及凋亡的影響24-28
• 四、miR-34a對(duì)CMP、GMP發(fā)育的影響28-30
• 討論30-32
• 第二部分 miR-34a的靶基因分析及驗(yàn)證32-49
• 材料和方法32-40
• 一、實(shí)驗(yàn)材料32-34
• 二、實(shí)驗(yàn)方法34-40
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-47
• 一、miR-34a靶基因的生物學(xué)預(yù)測(cè)40-41
• 二、miR-34a報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建41-45
• 三、N-myc是否是miR-34a在MDSCs發(fā)育過(guò)程中靶基因的驗(yàn)證45-47
• 討論47-49
• 第三部分 miR-34a對(duì)MDSCs功能的研究49-58
• 材料和方法50-53
• 一、實(shí)驗(yàn)材料50
• 二、實(shí)驗(yàn)方法50-53
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-56
• 討論56-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 綜述63-86
• 參考文獻(xiàn)76-86
• 碩士期間完成的論文86-87
• 附錄87-90
• 致謝90

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳金明,林菊生,陳碧濤,鄭新民,趙浩斌,梁擴(kuò)寰;乙型肝炎病毒基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備與鑒定[J];中華肝臟病雜志;2003年06期

2 林紅英;殷潤(rùn)婷;奚濤;徐寒梅;;在腫瘤研究中轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2007年01期

3 ;美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)規(guī)劃討論轉(zhuǎn)基因小鼠模型[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));1998年04期

4 罕園園;馬開利;;阿爾茲海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究進(jìn)展及評(píng)價(jià)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2013年06期

5 洪源;成軍;李莉;;丙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究[J];世界華人消化雜志;2002年09期

6 董田甜;任雁;鄒莉波;李增剛;王捷;;轉(zhuǎn)基因小鼠模型在致癌實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2011年08期

7 崔雄鷹;施小鳳;黃建松;劉萍;陶嵐嵐;周玉蘭;阮錚;奚曉東;;造血干細(xì)胞移植建立血小板整合素β3胞內(nèi)段截短體轉(zhuǎn)基因小鼠模型[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2013年03期

8 馮世容;應(yīng)用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)建立丙型肝炎轉(zhuǎn)基因小鼠模型獲得可喜進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);1998年23期

9 姚玉成,訾曉淵,李建秀,熊俊,李文林,金艷花,蘇小平,倪文君,胡以平,李振林,安靚,楊俊峰,羅清禮,張文,周久模;視蛋白基因啟動(dòng)子-綠色熒光蛋白融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年11期

10 張梅英;吳紅聯(lián);楊葳;李兆陽(yáng);董婉維;周生來(lái);于洋;王惟;呂相川;秦英;鄭志紅;王祿增;;5-脂氧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2010年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張梅英;吳紅聯(lián);楊葳;李兆陽(yáng);董婉維;周生來(lái);于洋;王惟;呂相川;秦英;鄭志紅;王祿增;;5-脂氧化酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備[A];東北三省及內(nèi)蒙古地區(qū)遺傳學(xué)研究進(jìn)展學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

2 何學(xué)令;尹海林;黃磊;夏慶杰;;甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2持續(xù)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立[A];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第七屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

3 亓s，

本文編號(hào)：268739