發(fā)布時(shí)間：2017-10-08 04:00

  本文關(guān)鍵詞：ATF3在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 急性肺損傷 脂多糖 活化轉(zhuǎn)錄因子3 TL1A RNA干擾 基因芯片

【摘要】：1.背景和目的急性肺損傷(acute lung injury,ALI),急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是因?yàn)楦鞣N肺內(nèi)、外因素所致的以肺泡毛細(xì)血管膜彌漫性損傷、嚴(yán)重低氧血癥為特征的呼吸危重癥,因外其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,所以仍有較高的病死率。其中,炎癥反應(yīng)失衡在疾病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。由革蘭陰性桿菌感染引起的膿毒血癥是導(dǎo)致ALI/ARDS的重要病因,而脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)作為革蘭陰性桿菌的胞壁成分是先天性免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)子,是導(dǎo)致ALI/ARDS的重要原因之一。因此,明確LPS導(dǎo)致炎癥損傷的發(fā)病機(jī)制對(duì)急性肺損傷的治療有重要意義。目前已證實(shí),轉(zhuǎn)錄活化因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是一應(yīng)激早期快反應(yīng)基因,其表達(dá)與炎癥反應(yīng)、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。在多種炎癥模型中,ATF3對(duì)炎癥反應(yīng)起剎車(chē)作用。然而,ATF3在LPS致急性肺損傷中的作用尚不完全清楚。鑒于此,本課題擬通過(guò)比較腹腔注射LPS后的野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的各項(xiàng)炎癥指標(biāo),明確ATF3在LPS致急性肺損傷小鼠模型中的作用;將兩組小鼠肺組織通過(guò)基因芯片技術(shù)尋找其差異基因;并最后通過(guò)構(gòu)建干擾質(zhì)粒下調(diào)ATF3在小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá),探討ATF3調(diào)控LPS導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制,從而為急性肺損傷的防治提供潛在的新靶點(diǎn)。2.研究方法(1)構(gòu)建急性肺損傷動(dòng)物模型,并明確ATF3在動(dòng)物模型中的表達(dá)規(guī)律向小鼠進(jìn)行腹腔注射LPS,注射量為15mg/kg,從而建立急性肺損傷小鼠的動(dòng)物模型,分別采取RT-PCR以及Western blot的方法,檢測(cè)ATF3在LPS刺激后的各個(gè)時(shí)相點(diǎn),小鼠肺組織中的表達(dá)情況,從而明確其表達(dá)規(guī)律。(2)觀察ATF3對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用構(gòu)建ATF3敲基因小鼠,用Western blot的方法鑒定敲基因小鼠中ATF3的表達(dá)缺失,通過(guò)比較野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的肺組織病理切片、肺組織濕干比、肺組織中炎癥因子的表達(dá)水平、肺泡灌洗液蛋白濃度以及7天存活率來(lái)評(píng)估ATF3對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。(3)利用基因芯片技術(shù)篩選急性肺損傷小鼠中與atf3相關(guān)的差異基因同時(shí)用lps對(duì)c57小鼠及atf3敲基因小鼠進(jìn)行腹腔注射后2小時(shí),然后提取兩組小鼠肺組織的總rna,通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因。再結(jié)合文獻(xiàn)閱讀,最終重點(diǎn)關(guān)注tl1a分子,并提出atf3可能是通過(guò)下調(diào)tl1a的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)急性肺損傷的炎癥保護(hù)作用這一假說(shuō)。(4)以小鼠單核巨噬細(xì)胞株raw264.7細(xì)胞為模型探討atf3在lps誘導(dǎo)的急性肺損傷中的可能機(jī)制用rt-pcr和westernblot的方法比較raw264.7細(xì)胞中,atf3在lps刺激后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。構(gòu)建質(zhì)粒,用rna干擾的方法下調(diào)atf3在raw264.7細(xì)胞中的表達(dá),觀察atf3對(duì)lps誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷以及信號(hào)分子通路tl1a表達(dá)的影響;采用sirna雙干擾技術(shù)同時(shí)下調(diào)atf3和tl1a在raw264.7細(xì)胞中的表達(dá)后,通過(guò)檢測(cè)炎癥因子il-6的表達(dá)變化說(shuō)明tl1a信號(hào)通過(guò)在atf3調(diào)控lps誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用。3.結(jié)果(1)atf3表達(dá)于正常小鼠肺組織,lps腹腔注射后,小鼠肺組織內(nèi)atf3的表達(dá)水平明顯增加(p0.05),以lps腹腔注射2h時(shí)相點(diǎn)達(dá)表達(dá)高峰,rt-pcr與westernblot的結(jié)果趨勢(shì)一致。(2)將野生型小鼠與atf3敲基因小鼠作為對(duì)比,lps腹腔注射以后,atf3敲基因小鼠的肺組織病理?yè)p傷加重,肺組織濕干比增加,炎癥因子il-6、il-1β、tnf-α表達(dá)增加,肺泡灌洗液蛋白濃度增加,小鼠7天存活率顯著下降(p0.05)。(3)從基因芯片的結(jié)果中找到了atf3敲基因小鼠和野生型小鼠的差異基因tl1a,結(jié)合閱讀文獻(xiàn),提出了atf3可能通過(guò)下調(diào)tl1a表達(dá),對(duì)lps誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥起到調(diào)控作用的科學(xué)假說(shuō)。(4)lps刺激后,atf3在raw264.7細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào),表達(dá)高峰點(diǎn)在lps處理6h后,下調(diào)atf3的表達(dá)會(huì)增加lps誘導(dǎo)的炎癥因子tnf-α和il-6的釋放;與lps和ncsirna+lps組相比,atf3sirna組和atf3sirna+lps組raw264.7細(xì)胞中tl1a的表達(dá)顯著增加(p0.05),為進(jìn)一步證實(shí)tl1a信號(hào)通路在atf3調(diào)控lps誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用,我們同時(shí)下調(diào)了atf3和tl1a在raw264.7細(xì)胞中的表達(dá),與atf3sirna+lps組相比,atf3sirna+tl1asirna組raw264.7細(xì)胞中il-6的表達(dá)顯著降低(p0.05)。4.結(jié)論(1)ATF3對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷有保護(hù)作用;(2)TL1A信號(hào)通路可能參與了ATF3對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 脂多糖 活化轉(zhuǎn)錄因子3 TL1A RNA干擾 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R563.8
【目錄】：

• 略縮語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 ATF3對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用13-28
• 2.1 材料與方法13-23
• 2.2 結(jié)果23-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結(jié)27-28
• 第三章 ATF3對(duì)急性肺損傷小鼠保護(hù)作用的可能機(jī)制28-42
• 第一部分 基因芯片結(jié)果28-33
• 3.1.1 材料與方法28-29
• 3.1.2 結(jié)果29-31
• 3.1.3 討論31-32
• 3.1.4 小結(jié)32-33
• 第二部分 ATF3在小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7 細(xì)胞中的作用和機(jī)制研究33-42
• 3.2.1 材料與方法33-36
• 3.2.2 結(jié)果36-40
• 3.2.3 討論40-41
• 3.2.4 小結(jié)41-42
• 全文總結(jié)42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 文獻(xiàn)綜述 ATF3與炎癥調(diào)控46-54
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文54-55
• 致謝55

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