本文關(guān)鍵詞：基于鹽皮質(zhì)激素受體中介的單核巨噬細(xì)胞表型調(diào)控對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化的干預(yù)研究

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【摘要】：目的：特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種病因未明的、慢性致死性的且病程不可逆的纖維化疾病，由于其發(fā)病過(guò)程的自身特點(diǎn)，很難找到有效的預(yù)防和治療方法。IPF的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前主要觀點(diǎn)包括：炎癥和免疫機(jī)制、肺泡上皮細(xì)胞損傷及異常的修復(fù)機(jī)制、氧化應(yīng)激及其信號(hào)途徑、促凝機(jī)制等，其中炎癥反應(yīng)的異常調(diào)節(jié)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中仍發(fā)揮重要的作用。單核巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性，亦即具有不同功能的亞群，是近年來(lái)免疫相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)之一，外周血單核細(xì)胞亞群和肺巨噬細(xì)胞表型偏移失衡與肺纖維化病理進(jìn)展關(guān)系密切。鹽皮質(zhì)激素受體（MR）除了存在于心血管系統(tǒng)及腎臟靶細(xì)胞外，在單核巨噬細(xì)胞也有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，鹽皮質(zhì)激素受體參與了單核巨噬細(xì)胞表型的偏移調(diào)節(jié)。脂質(zhì)體（liposome）能夠特異性靶向巨噬細(xì)胞，載藥脂質(zhì)體是一種針對(duì)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)有效的給藥方式。 本研究首先觀察博萊霉素誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型中，循環(huán)單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞及肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞不同亞群在實(shí)驗(yàn)性肺纖維化小鼠不同病理生理時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，探討循環(huán)中、肺泡腔及肺間質(zhì)來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)表型偏移與肺組織炎癥和纖維化的關(guān)系。然后，采用MR阻斷劑螺內(nèi)酯脂質(zhì)體干預(yù)后分別檢測(cè)循環(huán)單核細(xì)胞和肺組織巨噬細(xì)胞不同亞群的變化，及其對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的早期炎癥及后期纖維化的作用。 方法：100只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組（NS）、博萊霉素組（BLM），乙醚輕度麻醉后經(jīng)口咽吸入法分別給予40μL無(wú)菌生理鹽水及相同體積博萊霉素A5（2.5mg/kg），在造模后第1d、3d、7d、14d及21d麻醉后處死小鼠，未灌洗組小鼠左肺用于病理學(xué)檢測(cè)，分別用炎癥評(píng)分（Inflammation score, IS），膠原容積分?jǐn)?shù)（Collagen volume fraction,CVF）和α-SMA表達(dá)指標(biāo)表示各組小鼠肺組織炎癥及纖維化程度；常規(guī)方法進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)分析，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定BALF上清液中炎癥因子的含量；熒光定量PCR法檢測(cè)各組小鼠肺組織細(xì)胞因子及膠原的mRNA表達(dá)量，氯胺T法檢測(cè)肺組織羥脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)循環(huán)單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞（Alveolarmacrophage, AMφ）及肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞亞群（Interstitial macrophage, IMφ）的變化。 為了檢測(cè)阻斷鹽皮質(zhì)激素受體對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化的干預(yù)作用，雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組（NS）、博萊霉素組（BLM）、博萊霉素加空白脂質(zhì)體組（BLM+LC）、博萊霉素加螺內(nèi)酯脂質(zhì)體組（BLM+LS）及博萊霉素加普通螺內(nèi)酯組（BLM+SP），采用相同的博萊霉素給藥途徑和劑量造模，術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始至第21d，后3組小鼠分別給予空白脂質(zhì)體、螺內(nèi)酯脂質(zhì)體（20mg/kg）及相同劑量的普通螺內(nèi)酯灌胃處理，取材時(shí)間點(diǎn)及檢測(cè)方法同前。 結(jié)果：HE染色顯示，BLM組小鼠肺組織第3d可見(jiàn)明顯的支氣管周圍及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增寬等炎癥表現(xiàn)。造模后第1d至第21d，與NS組相比，BLM組小鼠肺組織IS明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中第7d達(dá)到峰值后呈下降趨勢(shì)。博萊霉素處理后第7d，BLM+LS組及BLM+SP組炎癥程度分別較各自對(duì)照組明顯降低（均P 0.05），不同劑型螺內(nèi)酯組之間無(wú)差異；與NS組相比，BLM組小鼠CVF在第7d增高，，第14d繼續(xù)增加，至第21d肺CVF達(dá)到最高。不同劑型螺內(nèi)酯干預(yù)第21d纖維化指數(shù)較各自對(duì)照組降低（均P 0.05）、α-SMA陽(yáng)性區(qū)域下降（均P 0.01），螺內(nèi)酯脂質(zhì)體組平均水平略低于普通螺內(nèi)酯組。與病理檢測(cè)一致，BLM組小鼠HYP含量第7d至第21d均高于NS組，螺內(nèi)酯脂質(zhì)體及普通螺內(nèi)酯干預(yù)第21d，HYP含量較各自對(duì)照組降低（均P 0.05），螺內(nèi)酯脂質(zhì)體組HYP平均含量低于普通螺內(nèi)酯組。 BLM組BALF細(xì)胞總數(shù)從第3d開(kāi)始至第21d均較NS組升高（P 0.01），其中第7d達(dá)到最高。巨噬細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)變化趨勢(shì)相同，中性粒細(xì)胞數(shù)量第1d至第7d顯著高于NS組（均P 0.01），第14d后降低與NS組無(wú)差異。BLM組淋巴細(xì)胞第3d至第21d均高于NS組，其中第14d淋巴細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值。在炎癥程度最高的第7d，與各自對(duì)照組相比，BLM+LS組及BLM+SP組均降低炎癥細(xì)胞總數(shù)及各組份細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與NS組相比，BLM組小鼠在急性炎癥期（第1,3,7d）肺組織IL-1β、CCL2和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯升高，纖維化進(jìn)展期（第14，21d）Col I、Col III的表達(dá)水平顯著升高（均P 0.01）。在博萊霉素誘導(dǎo)的炎癥期，螺內(nèi)酯脂質(zhì)體明顯下調(diào)了IL-1β、TNF-α及CCL2的mRNA表達(dá)水平，而普通螺內(nèi)酯干預(yù)第7d，CCL2的表達(dá)水平與其對(duì)照組相比變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。博萊霉素處理組第3d精氨酸酶-1（Arg-1）的mRNA表達(dá)水平較生理鹽水組升高（P 0.05），第7dArg-1表達(dá)進(jìn)一步升高，不同劑型螺內(nèi)酯干預(yù)下調(diào)了Arg-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致，ELISA結(jié)果表明，螺內(nèi)酯脂質(zhì)體降低了博萊霉素誘導(dǎo)的炎癥期BALF上清液中IL-1β、CCL2及TNF-α的含量。與其對(duì)照組相比，普通螺內(nèi)酯干預(yù)第7d TNF-α含量降低無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與NS組相比，博萊霉素干預(yù)后循環(huán)單核細(xì)胞表面Ly6C分子表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。Ly6Chi單核細(xì)胞亞群（經(jīng)典型）在博萊霉素作用后第1d比例迅速升高（P 0.01），第3d達(dá)到高峰，而后逐漸下降直至第21d，Ly6Clo單核細(xì)胞亞群（非經(jīng)典型）比例變化與Ly6Chi亞群變化趨勢(shì)相反；不同時(shí)間點(diǎn)肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞主要為M1表型，然而博萊霉素干預(yù)后第3d選擇性激活肺泡巨噬細(xì)胞（Alternatively activated AMφ, M2表型）比例升高，第14d達(dá)到高峰后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。經(jīng)酶解法獲得的肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞在博萊霉素干預(yù)后第1d至第14d表型無(wú)明顯變化，而第21d選擇性激活的間質(zhì)巨噬細(xì)胞（M2表型IMφ）比例升高（P 0.01）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例與肺炎癥反應(yīng)呈明顯正相關(guān)，M2型AMφ比例與膠原沉積呈明顯正相關(guān)；相應(yīng)的Ly6Clo單核細(xì)胞及M1型AMφ分別與炎癥和纖維化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。然而，間質(zhì)巨噬細(xì)胞與以上病理學(xué)指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。與對(duì)照組相比，螺內(nèi)酯脂質(zhì)體干預(yù)第3d循環(huán)Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例明顯降低（P 0.01），第14d明顯減弱了博萊霉素誘導(dǎo)的M2表型AMφ升高趨勢(shì)（P 0.05）。螺內(nèi)酯普通劑型與螺內(nèi)酯脂質(zhì)體作用一致，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：本研究闡明了博萊霉素誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠肺損傷及纖維化模型中，循環(huán)單核細(xì)胞、AMφ及IMφ不同亞群的動(dòng)態(tài)變化。即博萊霉素作用后循環(huán)Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例迅速升高，之后伴隨著M2表型肺泡巨噬細(xì)胞比例的升高。二者分別與肺炎癥反應(yīng)和纖維化程度呈明顯正相關(guān)。經(jīng)酶解法制備的間質(zhì)巨噬細(xì)胞表型變化不明顯。阻斷鹽皮質(zhì)激素受體減輕了博萊霉素誘導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)及后期纖維化程度，部分是通過(guò)降低炎癥早期快速升高的Ly6Chi單核細(xì)胞數(shù)量及抑制肺泡巨噬細(xì)胞選擇性激活（向M2表型偏移）實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：肺纖維化 博萊霉素 單核巨噬細(xì)胞表型 螺內(nèi)酯 鹽皮質(zhì)激素受體 脂質(zhì)體
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 引言13-15
• 第一部分 博萊霉素誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型中循環(huán)單核細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞表型的動(dòng)態(tài)演變15-47
• 前言15
• 材料與方法15-29
• 結(jié)果29-32
• 附圖32-39
• 附表39-40
• 討論40-41
• 小結(jié)41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 第二部分 靶向性阻斷鹽皮質(zhì)激素受體通過(guò)調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞表型偏移減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化47-73
• 前言47-48
• 材料與方法48-55
• 結(jié)果55-59
• 附圖59-65
• 附表65-66
• 討論66-68
• 小結(jié)68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 綜述 單核巨噬細(xì)胞在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用73-87
• 參考文獻(xiàn)80-87
• 致謝87-88
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Early lung injury contributes to lung fibrosis via AT1 receptor in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年02期

本文編號(hào)：967666