研究背景：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin, mTOR)參與了包括細(xì)胞代謝、增殖和自噬等在內(nèi)的大部分生理過(guò)程;同時(shí),也調(diào)控了許多代謝和增殖相關(guān)的疾病,如糖尿病、肥胖、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等。目前mTOR-細(xì)胞自噬通路在人體疾病中的研究方興未艾,但是該信號(hào)通路在呼吸系統(tǒng)疾病,特別是對(duì)于上皮細(xì)胞在急性肺損傷(acute lung injury, ALI)中的作用關(guān)注甚少,其調(diào)控機(jī)制也尚未明確。目的：建立脂多糖(LPS)干預(yù)肺上皮細(xì)胞的體外感染模型和誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的動(dòng)物感染模型,探索mTOR和細(xì)胞自噬在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法：建立體外LPS干預(yù)人HBE細(xì)胞的感染模型,采用Q-PCR和ELISA法檢測(cè)HBE細(xì)胞及其上清中炎癥因子的變化；采用Western Blot法檢測(cè)HBE細(xì)胞中mTOR-自噬相關(guān)信號(hào)通路中重要蛋白以及NF-κB信號(hào)通路中p65,p-p65的表達(dá)。此外,將已鑒定的8周齡左右的mTOR肺泡或氣道上皮條件性敲除小鼠隨機(jī)分為4組,即對(duì)照組、對(duì)照模型組,實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組氣道滴注PBS (50μl),其相應(yīng)模型組氣道滴注LPS (2mg/50μl)。觀察并測(cè)定各組小鼠肺灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、肺組織病理學(xué)、肺水腫、肺血管通透性的改變；采用ELISA法檢測(cè)BALF中炎癥因子的表達(dá),采用Q-PCR法測(cè)定肺組織中的炎癥因子的表達(dá)；采用Western Blot法測(cè)定mTOR-自噬信號(hào)通路中重要蛋白的變化。觀察mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除小鼠對(duì)生存率的影響。結(jié)果：目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS干預(yù)的HBE細(xì)胞和誘導(dǎo)的急性肺損傷模型都能明顯上調(diào)mTOR的磷酸化水平,并且抑制自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ的表達(dá)。同時(shí),活化的mTOR能激活TLR4信號(hào)通路。利用mTOR敲除或自噬相關(guān)蛋白(LC3B, ATG5和BECN1)過(guò)表達(dá)的HBE細(xì)胞能明顯降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)。相反,LPS刺激自噬相關(guān)基因(LC3B, ATG5和BECN1)敲除的細(xì)胞或自噬抑制劑(Baf-A1和CQ)干預(yù)的細(xì)胞可通過(guò)活化NF-κB信號(hào)通路上調(diào)IL-6和IL-8的表達(dá)。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以氣道滴注LPS建立小鼠ALI模型。LPS氣道滴注小鼠24小時(shí)后,與對(duì)照模型組比較,mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M能明顯減輕肺組織的病理?yè)p傷的程度,顯著改善肺水腫和肺血管滲透性的變化,降低肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)與白細(xì)胞計(jì)數(shù),下調(diào)炎癥因子的表達(dá)(如IL-6、KC、MIP-2等),提高小鼠生存率。結(jié)論：LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型能明顯上調(diào)mTOR的磷酸化表達(dá),該作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制細(xì)胞的自噬過(guò)程,隨之激活NF-κB信號(hào)通路調(diào)控其下游炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此,抑制肺上皮細(xì)胞mTOR的表達(dá)為臨床上治療ALI提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 自噬 炎癥
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 縮略語(yǔ)中英文對(duì)照10-13
• 1. 前言13-15
• 2. 材料與方法15-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器15-16
• 2.3 實(shí)驗(yàn)材料與試劑16-21
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法21-34
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-74
• 3.1 LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的建立34-36
• 3.2 mTOR-細(xì)胞自噬信號(hào)通路參與了急性肺損傷的炎癥反應(yīng)36-46
• 3.3 在LPS誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞中,TLR4-Myd88信號(hào)通路對(duì)mTOR-細(xì)胞自噬途徑的調(diào)控機(jī)制46-50
• 3.4 在LPS誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞中,mTOR-細(xì)胞自噬途徑對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制50-54
• 3.5 mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的作用54-67
• 3.6 各種siRNA和cDNA在HBE細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)67-71
• 3.7 肺泡和氣道上皮mTOR條件性敲除小鼠敲除效率的驗(yàn)證71-74
• 4. 討論74-77
• 5. 結(jié)論77-78
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 綜述86-103
• 參考文獻(xiàn)94-103
• 附表103-106
• 作者簡(jiǎn)歷106
• 攻讀博士學(xué)位期間所取得的科研成果106-107

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