發(fā)布時間：2021-03-04 19:22

  研究背景：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mechanistic target of rapamycin, mTOR)參與了包括細胞代謝、增殖和自噬等在內(nèi)的大部分生理過程;同時,也調(diào)控了許多代謝和增殖相關(guān)的疾病,如糖尿病、肥胖、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等。目前mTOR-細胞自噬通路在人體疾病中的研究方興未艾,但是該信號通路在呼吸系統(tǒng)疾病,特別是對于上皮細胞在急性肺損傷(acute lung injury, ALI)中的作用關(guān)注甚少,其調(diào)控機制也尚未明確。目的：建立脂多糖(LPS)干預(yù)肺上皮細胞的體外感染模型和誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的動物感染模型,探索mTOR和細胞自噬在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用及其相關(guān)調(diào)控機制。方法：建立體外LPS干預(yù)人HBE細胞的感染模型,采用Q-PCR和ELISA法檢測HBE細胞及其上清中炎癥因子的變化；采用Western Blot法檢測HBE細胞中mTOR-自噬相關(guān)信號通路中重要蛋白以及NF-κB信號通路中p65,p-p65的表達。此外,將已鑒定的8周齡左右的mTOR肺泡或氣道上皮條件性敲除小鼠隨機分為4組,即對照組、對照模型組,實驗組和實驗?zāi)Ｐ徒M。對照組和實驗組氣道滴注PBS (50μl),其相應(yīng)模型組氣道滴注LPS (2mg/50μl)。觀察并測定各組小鼠肺灌洗液中的細胞總數(shù)和白細胞分類計數(shù)、肺組織病理學(xué)、肺水腫、肺血管通透性的改變；采用ELISA法檢測BALF中炎癥因子的表達,采用Q-PCR法測定肺組織中的炎癥因子的表達；采用Western Blot法測定mTOR-自噬信號通路中重要蛋白的變化。觀察mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除小鼠對生存率的影響。結(jié)果：目前的實驗結(jié)果表明LPS干預(yù)的HBE細胞和誘導(dǎo)的急性肺損傷模型都能明顯上調(diào)mTOR的磷酸化水平,并且抑制自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ的表達。同時,活化的mTOR能激活TLR4信號通路。利用mTOR敲除或自噬相關(guān)蛋白(LC3B, ATG5和BECN1)過表達的HBE細胞能明顯降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子IL-6和IL-8的表達。相反,LPS刺激自噬相關(guān)基因(LC3B, ATG5和BECN1)敲除的細胞或自噬抑制劑(Baf-A1和CQ)干預(yù)的細胞可通過活化NF-κB信號通路上調(diào)IL-6和IL-8的表達。體內(nèi)動物實驗以氣道滴注LPS建立小鼠ALI模型。LPS氣道滴注小鼠24小時后,與對照模型組比較,mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除的實驗?zāi)Ｐ徒M能明顯減輕肺組織的病理損傷的程度,顯著改善肺水腫和肺血管滲透性的變化,降低肺泡灌洗液中細胞總數(shù)與白細胞計數(shù),下調(diào)炎癥因子的表達(如IL-6、KC、MIP-2等),提高小鼠生存率。結(jié)論：LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型能明顯上調(diào)mTOR的磷酸化表達,該作用機制可能是通過抑制細胞的自噬過程,隨之激活NF-κB信號通路調(diào)控其下游炎癥因子的表達來實現(xiàn)的。因此,抑制肺上皮細胞mTOR的表達為臨床上治療ALI提供了一個新的靶點。
【關(guān)鍵詞】：急性肺損傷 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 自噬 炎癥
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 縮略語中英文對照10-13
• 1. 前言13-15
• 2. 材料與方法15-34
• 2.1 實驗動物15
• 2.2 主要實驗設(shè)備及儀器15-16
• 2.3 實驗材料與試劑16-21
• 2.4 實驗方法21-34
• 3. 實驗結(jié)果34-74
• 3.1 LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的建立34-36
• 3.2 mTOR-細胞自噬信號通路參與了急性肺損傷的炎癥反應(yīng)36-46
• 3.3 在LPS誘導(dǎo)的HBE細胞中,TLR4-Myd88信號通路對mTOR-細胞自噬途徑的調(diào)控機制46-50
• 3.4 在LPS誘導(dǎo)的HBE細胞中,mTOR-細胞自噬途徑對NF-κB信號通路的調(diào)控機制50-54
• 3.5 mTOR肺泡和氣道上皮條件性敲除對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的作用54-67
• 3.6 各種siRNA和cDNA在HBE細胞中轉(zhuǎn)染效率的驗67-71
• 3.7 肺泡和氣道上皮mTOR條件性敲除小鼠敲除效率的驗證71-74
• 4. 討論74-77
• 5. 結(jié)論77-78
• 參考文獻78-86
• 綜述86-103
• 參考文獻94-103
• 附表103-106
• 作者簡歷106
• 攻讀博士學(xué)位期間所取得的科研成果106-107

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本文編號：961721