發(fā)布時間：2017-10-01 01:19

  本文關(guān)鍵詞：骨形成蛋白-4和粘蛋白1在哮喘發(fā)生中的作用及其機制

  更多相關(guān)文章： BMP4 Muc1 哮喘 卵清蛋白

【摘要】：【研究背景】 過敏性哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，常常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的可逆的支氣管阻滯和炎癥。該病往往在患者童年即出現(xiàn)癥狀，其形成一般經(jīng)歷致敏期、潛伏期和激活期三個階段。過敏性哮喘的發(fā)生與患者遺傳背景存在高度相關(guān)。因此，確定可以影響過敏性哮喘發(fā)病的各個階段的蛋白，將有助于了解過敏性哮喘發(fā)生的機制和發(fā)展針對性的治療措施。實際上，越來越多的研究表明，不少基因的改變，會增加患哮喘的風(fēng)險。這些基因往往涉及調(diào)控呼吸道上皮細胞對外界刺激反應(yīng)的敏感性（例如病毒和細菌感染，環(huán)境顆粒刺激等），或者調(diào)控免疫系統(tǒng)對致敏原的反應(yīng)敏感性。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一組分泌型的多功能肽類生長因子，為轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β家族中最大的亞群（其它亞群包括TGF-β和activin）。除BMPl外，其余成員均在結(jié)構(gòu)上與TGF-β相似。BMPs以前體蛋白形式被合成，當被剪切為有活性的成熟體BMPs并分泌至胞后，以同型或異型二聚體形式與2種絲氨酸-蘇氨酸激酶受體（BMPR-I和BMPR-II）結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，最終參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BMPs在組織再生和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，能夠影響多種細胞的增殖、分化、遷移和凋亡。BMP4是BMPs亞型中重要的分子之一，在內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和上皮細胞等皆有表達。BMP-4在胚胎肺發(fā)育中起關(guān)鍵作用。近年來越來越多的報道認為BMP4參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控。人類哮喘病人氣道上皮組織BMP7的表達升高，表明BMPs家族可能參與調(diào)控哮喘中肺部炎癥的發(fā)生。然而，至少一則報道認為，在以卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性氣道炎癥模型中，雖然氣道上皮細胞出現(xiàn)BMP信號活化、BMPR-I表達明顯增加，肺組織中BMP2和BMP6顯著上調(diào)，而BMP4卻呈現(xiàn)下降。但針對哮喘病人的臨床研究表明，氣道上皮細胞中的BMP4在哮喘患者和正常人之間沒有區(qū)別。因此，目前關(guān)于BMP4在過敏性哮喘中的表達情況及功能仍然存在爭議。 除了分泌型蛋白可能參與調(diào)控哮喘的發(fā)生，鉚定在細胞表面的蛋白也可能參與調(diào)控過敏性哮喘。粘蛋白1（Mucin1，Muc1）是一種主要分布在腺上皮細胞頂部，以及部分免疫細胞包括T細胞表面的跨膜蛋白，由胞外區(qū)（EC區(qū)）、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)（CT區(qū)）構(gòu)成。其CT區(qū)分布有酪氨酸磷酸化位點、GSK3β結(jié)合位點和β-catenin結(jié)合位點。這些位點的磷酸化或和配體結(jié)合，可以引起下游細胞信號的改變。近年來，MUC1被發(fā)現(xiàn)參與了肺部炎癥反應(yīng)的調(diào)控。在LPS引起的急性肺部炎癥模型中，Muc1缺失小鼠表現(xiàn)出更嚴重的炎癥反應(yīng)， Muc1起了抑制過度炎癥反應(yīng)的作用。但Muc1在哮喘發(fā)生中是否起了變化，以及Muc1在哮喘發(fā)生過程中是否有調(diào)控作用，都尚未有報道。 哮喘動物模型是研究哮喘發(fā)生的重要工具。目前應(yīng)用最廣泛的是小鼠哮喘動物模型。雖然哮喘動物模型目前很難完全模擬人類哮喘的全部特點，但某些哮喘的基本特征例如氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道粘液高分泌和氣道重塑等都能在小鼠哮喘模型中模擬出來。成功的哮喘動物模型至少應(yīng)具備氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的兩個基本特征。 【研究目的】 通過在BMP4和Muc1基因敲除小鼠上建立哮喘模型，觀察BMP4和Muc1蛋白在在哮喘疾病過程中的的變化情況，試圖闡明這兩種蛋白對哮喘發(fā)生的影響及其潛在機制。本研究將對尋找哮喘治療新的作用靶點具有積極意義。 【研究方法】 基因鑒定：①、切取部分小鼠尾尖組織，加入裂解液后55℃過夜，以充分裂解小鼠尾巴組織；②、將小鼠尾巴組織裂解液中的DNA提純；③、以已經(jīng)提純的小鼠尾巴組織DNA為模板，進行PCR反應(yīng)；④、PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠電泳后成像。 運用不同劑量卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激發(fā)小鼠，建立小鼠哮喘模型：①、哮喘動物模型的建立。建模過程分為3個基本階段：腹腔注射佐劑+致敏原的致敏階段，1到2周的等待階段，最后4天連續(xù)致敏原滴鼻的激發(fā)階段。等待時間會根據(jù)造模小鼠不同遺傳背景而做調(diào)整。②、小鼠肺功能測定及實驗標本的收集。造模結(jié)束后，用無創(chuàng)體描儀（plethysmography）法測定小鼠肺功能。隨后處死小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液、血清、肺組織等標本。 評估肺組織炎癥反應(yīng)程度：①、統(tǒng)計支氣管肺泡灌洗液中分類細胞數(shù)及計算其所占比例。②、使用實時定量RT-PCR方法，檢測肺組織及支氣管肺泡灌洗液總細胞中以下細胞因子的mRNA水平：IL4、IL5、IL17A、IL1β、MCPT-8和CCL-11。③、肺石蠟切片HE染色觀察肺組織炎癥反應(yīng)情況，過碘酸-雪夫染色（PAS染色）觀察氣道上皮杯狀細胞增生及粘液分泌情況。 哮喘小鼠模型BMP4及Muc1表達水平檢測：①、使用Elisa法，檢測血清及支氣管肺泡灌洗液中BMP4成熟體蛋白的水平。使用蛋白免疫印跡方法，檢測肺組織中BMP4蛋白的表達水平。②、使用實時定量RT-PCR方法，檢測肺組織中BMP4和Muc1的表達水平。 【實驗結(jié)果】 1、哮喘發(fā)生時BMP4蛋白的變化情況及功能。 1.1哮喘發(fā)生后，肺組織中BMP4蛋白表達保持穩(wěn)定，但支氣管肺泡灌洗液中分泌型BMP4增加。其分泌增加與激發(fā)致敏原劑量相關(guān)。 1.2低劑量致敏原激發(fā)的哮喘模型小鼠中，BMP4+/+和BMP4+/-兩種小鼠在炎癥反應(yīng)的表型上沒有區(qū)別。 BMP4+/+和BMP4+/-兩種小鼠均出現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中細胞增多，肺組織炎癥細胞浸潤等炎癥癥狀，其中主要細胞類型為巨噬細胞和嗜酸性粒細胞，另外還有少量嗜中性粒細胞。肺組織Th2和Th17細胞因子水平上調(diào)，但Th1細胞因子水平變化不明顯，且在BMP4+/+和BMP4+/-小鼠之間沒有顯著性差異。 1.3僅高劑量致敏原激發(fā)處理即可引起B(yǎng)ALF中嗜中性粒細胞增加。在腹腔致敏結(jié)合高劑量激發(fā)引起的哮喘小鼠模型中，與BMP4+/-小鼠相比，BMP4+/+小鼠BAL fluid中出現(xiàn)更嚴重的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞增多現(xiàn)象，其肺組織Th1細胞因子IL1β水平更高，同時Th2細胞因子IL4水平相對下調(diào)。肺組織Th17細胞因子水平顯著上調(diào)但在兩種小鼠間沒有顯著性差異。與低劑量致敏原激發(fā)的哮喘相比，高劑量致敏原激發(fā)的哮喘出現(xiàn)明顯的中性粒細胞增多現(xiàn)象，其中BAL fluid嗜中性粒細胞總數(shù)在兩種小鼠之間的差異比低劑量時更為明顯。檢查BAL fluid總細胞中炎癥因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)BMP4+/+小鼠IL1β水平比BMP4+/-小鼠高，，而IL4、IL17A和CCL11水平低于BMP4+/-小鼠。 1.4嗜堿性細胞標志物MCPT-8在該方法引起的哮喘發(fā)生前后沒有明顯變化。 2、哮喘發(fā)生時Muc1蛋白的變化情況及功能。 2.1哮喘發(fā)生時，肺組織Muc1水平下調(diào)。 2.2Muc5ac在哮喘發(fā)生時上調(diào)，Muc1缺失不影響Muc5ac的上調(diào)。 2.3接受腹腔致敏的小鼠，肺組織Th1細胞因子IL1β水平下調(diào)。僅腹腔致敏不能引起肺部炎癥。 2.4僅致敏原激發(fā)處理不能引起肺部炎癥癥狀。 2.5哮喘模型組中，與Muc1-/-小鼠相比，Muc1+/+小鼠出現(xiàn)更嚴重哮喘癥狀，包括：①、支氣管肺泡灌洗液中總細胞數(shù)增加，增加的細胞絕大部分是嗜酸性粒細胞。②、肺組織出現(xiàn)更嚴重炎癥細胞侵潤、氣道上皮杯狀細胞增生和粘液分泌增高。③、肺組織Th2細胞因子IL5和Th17IL細胞因子17A、嗜酸性細胞趨化因子CCL11水平更高。而Th1細胞因子IL1β則呈現(xiàn)下調(diào)。 【實驗結(jié)論】 1、哮喘發(fā)生時BMP4分泌增加，并且與激發(fā)哮喘的致敏原劑量相關(guān)。 2、低劑量致敏原激發(fā)的哮喘中，BMP4+/+和BMP4+/-小鼠之間在肺部炎癥反應(yīng)上沒有顯著性差異。高劑量致敏原激發(fā)的哮喘中，與BMP4+/-小鼠比較，BMP4+/+小鼠出現(xiàn)更強的肺部炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為更顯著的炎性細胞浸潤。與低劑量激發(fā)哮喘組相比，高劑量致敏原在BMP4+/+小鼠中引起明顯的嗜中性粒細胞增多。提示BMP4蛋白可能在哮喘發(fā)病中起調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用，尤其可能影響多見于重癥哮喘的嗜中性粒細胞增多。 3、由于哮喘發(fā)生時肺組織Muc1表達下調(diào)，而Muc1完全缺失的小鼠哮喘癥狀卻更輕，那么Muc1的存在有可能促使了哮喘的發(fā)生。肺組織中Muc1下調(diào)可能是肺組織Muc1主要來源的氣道上皮細胞在炎癥發(fā)生中受損的結(jié)果。 4、由于Muc1同時也在T細胞表面表達，并參與調(diào)控活化后的T細胞對致敏原的反應(yīng)。而僅致敏原激發(fā)處理并沒有引起任何癥狀，那么，Muc1有可能通過影響腹腔致敏的過程從而影響激發(fā)后的肺部炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：BMP4 Muc1 哮喘 卵清蛋白
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 中英文對照詞匯表3-5
• 中文摘要5-10
• Abstract10-16
• 前言16-19
• 材料和方法19-34
• 1、材料與試劑19-25
• 2、實驗方法25-34
• 結(jié)果34-55
• 第一部分 BMP4 在哮喘發(fā)生中的作用34-45
• 一、 BMP4 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定34
• 二、 BMP4 在哮喘發(fā)生中的作用34-45
• 第二部分 MUC1 蛋白對在哮喘發(fā)生中的作用的初步研究45-55
• 一、 MUC1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定45-46
• 二、 獲得部分遺傳背景為 BABL/C 的 MUC1+/+和 MUC1-/-小鼠46
• 三、 MUC1 在哮喘發(fā)生中的作用46-55
• 討論55-61
• 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻63-66
• 文獻綜述66-70
• 參考文獻69-70
• 致謝70-71

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 姜麗巖,何禮賢,李善群,官孝群,胡必杰,瞿介明;免疫抑制宿主肺部炎癥反應(yīng)中白細胞介素8的表達[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;1999年10期

2 姜麗巖;白介素-8與肺部炎癥反應(yīng)[J];國外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊;1999年02期

3 張雁;ARDS肺部炎癥反應(yīng)的變化:預(yù)后的指征[J];國外醫(yī)學(xué).呼吸系統(tǒng)分冊;1996年04期

4 劉玲;邱海波;楊毅;丁惠民;王連;;血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ1型受體途徑在介導(dǎo)大鼠肺部炎癥反應(yīng)中的作用[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

5 譚靜;肖紅;譚建新;;腺苷A2b受體通過各種效應(yīng)細胞介導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的作用機制[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年24期

6 姜麗巖,何禮賢,李善群,瞿介明,胡必杰;免疫抑制豚鼠肺部炎癥反應(yīng)中TNF-α的表達[J];上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2000年05期

7 姜麗巖,何禮賢,瞿介明,胡必杰,李菁,李錫瑩;免疫抑制宿主肺部炎癥反應(yīng)及腫瘤壞死因子介導(dǎo)機制[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;1996年03期

8 呂民,張秀和,符韶鵬,姜亦忠,張柏民,孫雪峰;大鼠體外循環(huán)模型肺部炎癥反應(yīng)的研究[J];中國實驗診斷學(xué);2005年03期

9 呂民;張秀和;楊紹娟;姜亦忠;張柏民;;體外循環(huán)肺部炎癥反應(yīng)的研究[J];中國免疫學(xué)雜志;2006年10期

10 諶貽璞;對合理應(yīng)用激素治療SARS的思考[J];中國實用內(nèi)科雜志;2003年12期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 宋志芳;;糖皮質(zhì)激素與急性呼吸窘迫綜合征[A];第六屆全國危重病學(xué)術(shù)交流大會論文匯編[C];2005年

2 張民偉;;多發(fā)創(chuàng)傷激素治療的利與弊[A];中國危重病醫(yī)學(xué)大會-2011暨北京醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)年會匯編[C];2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李景棟;HSP70在百草枯誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)中的表達[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

2 龔裕強;茶多酚對急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）肺的保護作用[D];浙江大學(xué);2005年

本文編號：951516