本文關(guān)鍵詞：Notch信號通過ERK途徑參與CSE誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

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【摘要】：第一部CSE對肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和Notch信號表達(dá)的影響目的:研究香煙煙霧提取物(Cigarette smoking extract,CSE)干預(yù)對人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)凋亡的影響以及CSE能否影響HPMEC中Notch信號的表達(dá)。方法:體外培養(yǎng)HPMEC,分別使用不同濃度的CSE(0%,0.5%,1%,2.5%,5%)干預(yù)12h以及1%CSE干預(yù)不同時(shí)間(0,3h,6h,12h,24h),采用Annexin V-FITC/PI雙染,流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。將HPMEC分為對照組和CSE組,后者分別使用1%CSE干預(yù)6h、12h、24h,采用Real-time PCR檢測各組Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其靶基因Hes1、Hey2的m RNA表達(dá)。使用CSE對HPMEC干預(yù)24h,采用Western Blot檢測CSE干預(yù)前后Notch1、Notch2、Notch4及其靶基因Hes1、Hey2蛋白表達(dá)。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)CSE干預(yù)12h,與對照組比較,0.5%CSE即引起HPMEC凋亡增加(P0.05),在0.5%~2.5%濃度范圍內(nèi),隨著CSE濃度的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸增高,當(dāng)濃度達(dá)到5%時(shí),細(xì)胞凋亡率較2.5%組下降(P0.05),但壞死逐漸明顯。(2)選擇細(xì)胞凋亡率增長最快同時(shí)壞死率相對較低的1%CSE作為最佳干預(yù)濃度,使用1%CSE干預(yù)不同時(shí)間,與對照組比較,各CSE組細(xì)胞凋亡率均較對照組顯著升高,且在3h~12h范圍內(nèi),隨著干預(yù)時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡率逐漸增多,當(dāng)干預(yù)時(shí)間達(dá)到24h時(shí),細(xì)胞凋亡率與12h無顯著差異(P0.05)。(3)CSE干預(yù)6h,Notch1、Notch4 m RNA表達(dá)較對照組增加(P0.05);干預(yù)12h,Notch1、Notch4 m RNA表達(dá)與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);干預(yù)24h時(shí)Notch1、Notch4 m RNA及蛋白表達(dá)均較對照組顯著下降(P0.05)。(4)CSE干預(yù)6h,Notch2m RNA表達(dá)與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);干預(yù)12h,Notch2m RNA表達(dá)與對照組比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);干預(yù)24h時(shí)Notch2m RNA及蛋白表達(dá)均較對照組顯著增加(P0.05)。(5)CSE干預(yù)6h,Hes1、Hey2 m RNA表達(dá)與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);隨著干預(yù)時(shí)間的延長,Hes1、Hey2 m RNA表達(dá)逐漸下降,至干預(yù)24h時(shí),Hes1、Hey2 m RNA表達(dá)較對照組顯著下降(P0.05)。結(jié)論:(1)CSE可誘導(dǎo)HPMEC的凋亡,并呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。(2)CSE可以抑制Notch1、Notch4表達(dá),促進(jìn)Notch2表達(dá)。(3)CSE可能通過影響Notch信號及其靶基因的表達(dá)參與HPMEC凋亡。第二部分Notch1在CSE誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用目的:研究Notch1是否對CSE誘導(dǎo)的HPMEC凋亡起到保護(hù)作用。方法:構(gòu)建Notch1過表達(dá)質(zhì)粒,并使用慢病毒包裝。以Notch1過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染HPMEC,并使用1%CSE干預(yù)24h。將HPMEC分為五個(gè)處理組:空白對照組,過表達(dá)組,陰性病毒組,CSE+過表達(dá)組,CSE+陰性病毒組。Real-time PCR和Western Blot檢測各組Notch1 m RNA和蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)過表達(dá)組Notch1的表達(dá)水平顯著高于空白對照組和陰性病毒組(P0.05);陰性病毒組Notch1的表達(dá)與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);CSE干預(yù)后,過表達(dá)組和陰性病毒組Notch1的表達(dá)均較干預(yù)前下降(P0.05),但CSE+過表達(dá)組仍高于CSE+陰性病毒組(P0.05)。(2)過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率與空白對照組無顯著差異(P0.05),均顯著低于陰性病毒組(P0.05)。CSE干預(yù)后,過表達(dá)組和陰性病毒組細(xì)胞凋亡率均較未干預(yù)前明顯增高(P0.05),但過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率仍顯著低于陰性病毒組(P0.05)。結(jié)論:Notch1對CSE誘導(dǎo)的HPMEC凋亡起到保護(hù)作用。第三部分Notch1通過ERK途徑抑制肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡目的:探討Notch1是否通過ERK途徑參與CSE誘導(dǎo)的HPMEC凋亡。方法:體外培養(yǎng)HPMEC,首先檢測CSE干預(yù)前后ERK1、ERK2的變化,將HPMEC分為對照組和CSE組;其次檢測Notch1過表達(dá)對ERK1、ERK2的影響,將HPMEC分為五個(gè)處理組:空白對照組,過表達(dá)組,陰性病毒組,CSE+過表達(dá)組,CSE+陰性病毒組;最后檢測抑制ERK對Notch1的影響以及對細(xì)胞凋亡的影響,將HPMEC分為四個(gè)處理組:空白對照組,CSE組,PD98059組,CSE+PD98059組。采用Real-time PCR和Western Blot分別檢測ERK1、ERK2、Notch1 m RNA和蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)CSE干預(yù)6h,ERK1m RNA表達(dá)與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);隨著干預(yù)時(shí)間的延長,ERK1表達(dá)水平逐漸升高,至干預(yù)24h時(shí),無論ERK1m RNA還是蛋白表達(dá)均較對照組顯著增加(P0.05)。(2)CSE干預(yù)6h,ERK2m RNA表達(dá)較對照組增加(P0.05);隨著干預(yù)時(shí)間的延長,ERK2表達(dá)水平逐漸升高,至干預(yù)24h時(shí),無論ERK2m RNA還是蛋白表達(dá)均較對照組顯著增加(P0.05)。(3)過表達(dá)組ERK1和ERK2的表達(dá)水平均顯著低于空白對照組和陰性病毒組(P0.05);陰性病毒組ERK1和ERK2的表達(dá)與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);CSE干預(yù)后,過表達(dá)組和陰性病毒組ERK1和ERK2的表達(dá)均較干預(yù)前升高(P0.05),但CSE+過表達(dá)組仍低于CSE+陰性病毒組(P0.05)。(4)與對照組比較,CSE組、PD98059組、CSE+PD98059組Notch1的表達(dá)水平均顯著下降(P0.05),但該三組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(5)與對照組比較,CSE組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05),而CSE+PD98059組細(xì)胞凋亡率顯著低于CSE組。結(jié)論:CSE可以通過抑制Notch1的表達(dá),進(jìn)而激活ERK途徑,最終導(dǎo)致HPMEC凋亡。
【關(guān)鍵詞】：肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 香煙煙霧提取物 凋亡 Notch信號 ERK途徑
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563
【目錄】：

• 本課題資助基金5-6
• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-19
• 縮略詞表19-21
• 第一部分CSE對肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和Notch受體21-56
• 第一章 前言21-23
• 第二章 對象、材料和方法23-36
• 2.1 研究對象23
• 2.2 主要設(shè)備和試劑23-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法27-35
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35-36
• 第三章 結(jié)果36-49
• 3.1 CSE干預(yù)對HPMEC凋亡的影響36-39
• 3.2 Real-time PCR檢測CSE對HPMEC中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hey2m RNA表達(dá)的影響39-45
• 3.3 Western Blot檢測CSE對HPMEC中Notch1、Notch2、Notch4蛋白表達(dá)的影響45-49
• 第四章 討論49-55
• 4.1 細(xì)胞凋亡機(jī)制49-50
• 4.2 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與吸煙以及COPD的關(guān)系50-51
• 4.3 Notch信號通路與血管內(nèi)皮細(xì)胞51-52
• 4.4 CSE對HPMEC中Notch受體及其靶基因表達(dá)的影響52-55
• 第五章 結(jié)論55-56
• 第二部分Notch1在CSE誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用56-86
• 第一章 前言56-57
• 第二章 對象、材料和方法57-76
• 2.1 研究對象57
• 2.2 主要設(shè)備和試劑57-61
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法61-75
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析75-76
• 第三章 結(jié)果76-83
• 3.1 慢病毒轉(zhuǎn)染驗(yàn)證76-77
• 3.2 Western Blot檢測各組HPMEC中Notch1蛋白的表達(dá)77-79
• 3.3 Real-time PCR檢測各組HPMEC中Notch1m RNA的表達(dá)79-81
• 3.4 Annexin V/PI雙染法檢測各組HPMEC凋亡率81-83
• 第四章 討論83-85
• 第五章 結(jié)論85-86
• 第三部分Notch1通過ERK途徑抑制肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡86-116
• 第一章 前言86-88
• 第二章 對象、材料和方法88-96
• 2.1 研究對象88
• 2.2 主要設(shè)備和試劑88-92
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法92-95
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析95-96
• 第三章 結(jié)果96-113
• 3.1 Real-time PCR檢測CSE對HPMEC中ERK1、ERK2m RNA表達(dá)的影響96-98
• 3.2 Western Blot檢測CSE對HPMEC中ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)的影響98-100
• 3.3 Real-time PCR檢測過表達(dá)Notch1對HPMEC中ERK1、ERK2m RNA表達(dá)的影響100-102
• 3.4 Western Blot檢測過表達(dá)Notch1對HPMEC中ERK、ERK2蛋白表達(dá)的影響102-105
• 3.5 Real-time PCR檢測抑制ERK對HPMEC中Notch1m RNA表達(dá)的影響105-107
• 3.6 Western Blot檢測抑制ERK對HPMEC中Notch1蛋白表達(dá)的影響107-111
• 3.7 Annexin V/PI雙染法檢測抑制ERK對HPMEC凋亡的影響111-113
• 第四章 討論113-115
• 第五章 結(jié)論115-116
• 參考文獻(xiàn)116-126
• 綜述一126-135
• 參考文獻(xiàn)131-135
• 綜述二135-160
• Reference146-160
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果160-161
• 致謝161

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本文編號：951342