本文關(guān)鍵詞：CD39在過敏性哮喘的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的：已有研究證實(shí)胞外ATP-嘌呤受體信號(hào)通路參與過敏性哮喘的病理生理過程,ATP可被胞外核苷酸酶ENTPDase-1/CD39水解。在小鼠,CD39主要表達(dá)于CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。因此,本研究探討了CD39是否參與小鼠過敏性哮喘的病理生理過程及CD39是否介導(dǎo)了CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮抑制小鼠過敏性哮喘的作用。 方法：1)采用C57BL/6雌性小鼠(6-8周齡)建立雞卵清蛋白(OVA)致敏和激發(fā)的過敏性哮喘模型,以O(shè)VA非致敏的同背景雌性小鼠作為對(duì)照,于最后一次激發(fā)的48小時(shí),小鼠被安樂死,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD39在肺組織的定位,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)及蛋白免疫印跡法定量肺組織內(nèi)CD39的核酸及蛋白水平。2)采用C57BL/6雌性小鼠建立OVA致敏和激發(fā)的過敏性哮喘模型,于激發(fā)前給予不同的處理即CD39抑制劑(ARL67156)、三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)+ARL67156及PBS,并以O(shè)VA非致敏的同背景雌性小鼠作為對(duì)照,于最后一次激發(fā)的48小時(shí),處理小鼠并完成氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的測(cè)定。具體如下：蘇木精-伊紅染色(HE)及過碘酸-雪夫氏染色(PAS)評(píng)價(jià)肺組織內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥及支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生；血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液的總細(xì)胞,細(xì)胞離心制備細(xì)胞涂片,瑞氏-姬姆薩染色并計(jì)數(shù)分類細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中OVA特異性免疫球蛋白(IgE)及支氣管肺泡灌洗液上清中細(xì)胞因子(IL-4,IL-5,IL-13,IL-17,及IFN-γ)水平；qPCR方法測(cè)定肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(GATA3、RORγt)及嘌呤受體(P2Y2、P2Y6)核酸水平；氣道高反應(yīng)性通過有創(chuàng)法測(cè)定氣道阻力和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性。3)選取CD39基因敲除小鼠及同背景的野生型C57BL/6雌性小鼠,OVA致敏和激發(fā)誘導(dǎo)過敏性哮喘模型。取肺組織,HE及PAS染色觀察氣道炎癥及杯狀細(xì)胞增生粘液分泌情況；計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞總數(shù),細(xì)胞離心后行瑞氏-姬姆薩染色后計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞數(shù),ELISA法測(cè)定支氣管肺泡灌洗液上清中Th2及Thl7相關(guān)細(xì)胞因子水平。4)選取野生型和CD39基因敲除型的FOXP3-GFP-KI的C57BL/6雄性小鼠(6-14周齡),結(jié)合磁珠及流式細(xì)胞術(shù)方法分選小鼠脾臟CD4+GFP+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。選取C57BL/6雌性小鼠建立OVA致敏和激發(fā)的過敏性哮喘模型,于OVA第一次激發(fā)前1小時(shí),經(jīng)尾靜脈注入分選的CD39+CD4+GFP+和CD39-CD4+GFP+的T細(xì)胞。取對(duì)照組和哮喘小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定脾臟單個(gè)核細(xì)胞中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例；取肺組織,HE及PAS染色觀察氣道炎癥及杯狀細(xì)胞增生粘液分泌情況。進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,計(jì)數(shù)灌洗液的細(xì)胞總數(shù),細(xì)胞離心后行瑞氏-姬姆薩染色并計(jì)數(shù)不同種類的炎性細(xì)胞數(shù),ELISA法測(cè)定支氣管肺泡灌洗液上清中Th2及Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平；氣道高反應(yīng)性通過有創(chuàng)法測(cè)定氣道阻力和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性。5)體外共培養(yǎng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與效應(yīng)性T細(xì)胞,并給與腺苷A2A受體拮抗劑,培養(yǎng)三天后收集上清,ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子水平。 結(jié)果：1)CD39在肺組織主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞及免疫炎性細(xì)胞,及少量表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞；過敏性哮喘小鼠肺組織內(nèi)CD39的表達(dá)明顯下降。2)CD39抑制劑ARL67156加重過敏性哮喘的主要特征,具體表現(xiàn)：肺組織內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞增多、氣道杯狀細(xì)胞增生明顯及粘液分泌增加、Th2和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子水平增加及氣道反應(yīng)性增高；氣管內(nèi)給予三磷酸腺苷雙磷酸酶Apyrase預(yù)處理可降低ARL67156加重的上述炎癥指標(biāo)。3)與野生型哮喘小鼠相比,CD39基因敲除小鼠表現(xiàn)出加重的氣道炎癥。4)過敏性哮喘小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量明顯減少。外源性補(bǔ)充CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可抑制過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥及降低氣道高反應(yīng)性；與CD39"CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相比,CD39+CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制氣道炎癥功能。5)體外共培養(yǎng)結(jié)果示CD39+CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞除可抑制Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子外,還可抑制IL-17產(chǎn)生。 結(jié)論：1)過敏性哮喘小鼠肺組織內(nèi)的CD39表達(dá)量不足。2)CD39抑制劑可加重過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥,這可能與哮喘時(shí)嘌呤受體(P2R)過度表達(dá)有關(guān)。3)CD39介導(dǎo)了CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮抑制過敏性哮喘氣道炎癥和降低氣道高反應(yīng)性的作用,主要是通過抑制IL-17產(chǎn)生發(fā)揮抑制氣道炎癥作用。
【關(guān)鍵詞】：過敏性哮喘 CD39 胞外ATP 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點(diǎn)6-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 1 前言12-16
• 第一部分 CD39在小鼠過敏性哮喘中的作用16-48
• 2 材料和方法16-34
• 3 研究結(jié)果34-44
• 4 討論44-48
• 第二部分 CD4~+CD39~+Foxp~(3+)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減輕過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥48-62
• 5 材料和方法48-51
• 6 研究結(jié)果51-59
• 7 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 綜述 ENTPDasel/CD39免疫調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展70-85
• 參考文獻(xiàn)77-85
• 攻博期間發(fā)表的相關(guān)論文成果85-86
• 致謝86

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本文編號(hào)：949162