本文關(guān)鍵詞：一肺泡微石癥家系臨床特點及致病基因研究

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【摘要】：肺泡微石癥(Pulmonary alveolar microlithiasis,PAM)是一種罕見的緩慢進展的肺部疾病。特征是中下肺野肺泡內(nèi)出現(xiàn)廣泛球形鈣化灶(磷酸鈣鹽或稱為微結(jié)石)的聚集。大多數(shù)病人在診斷時是無癥狀的,通常是在常規(guī)體檢過程中偶然發(fā)現(xiàn)疾病的存在,癥狀主要表現(xiàn)為反復(fù)的咳嗽或漸進性呼吸困難。疾病的發(fā)生可以是散發(fā)的也可以是家族性的,PAM有大約為38-61%是家族性發(fā)病的,屬于常染色體隱性遺傳病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,關(guān)于其病因的研究已經(jīng)取得了顯著進展,目前認為肺泡上皮內(nèi)是編碼Ⅱb型磷酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NaPi-Ⅱb)的SLC34A2基因((solute carrie family34member2,溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族34成員2)突變引起富含磷酸鈣的微結(jié)石在肺泡內(nèi)形成和聚集,是本病發(fā)生的主要原因。SLC34A2屬于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白家族SLC34的成員之一,在人體內(nèi)多種組織器官均有表達。對于維持體內(nèi)無機磷的代謝平衡起著至關(guān)重要的作用。在臨床工作中,我們發(fā)現(xiàn)了一個近親婚配的PAM家系,該家系共有4名患者,他們是同胞。本文主要對這個PAM家系進行臨床特征分析、致病基因檢測,從而為PAM的發(fā)病機制、遺傳學(xué)特點及治療策略的研究提供研究幫助。 本研究對象為中國吉林省松原市一個典型的肺泡微石癥家系。該家系為近親結(jié)婚家庭,共有3代12人,本家系第一代為親表兄妹近親結(jié)婚,均健在,第二代直系子女4人,3男1女,根據(jù)其典型的影像學(xué)變化及病理改變,診斷為PAM死亡2人,第三代3人,第一代及第三代行常規(guī)胸片檢查均未見發(fā)病。該家系具有明顯的家族聚集性和遺傳穩(wěn)定性,是研究PAM致病基因理想的家系。 材料和方法： 本研究第一部分詳細收集該家系4名患者臨床資料,對于其臨床特點進行分析、總結(jié)。第二部分對該家系所能聯(lián)系到的9位家庭成員在嚴格無菌操作下采外周血5m1,另選取10例體檢健康的無關(guān)正常人外周血作為對照,SLC34A2基因位于4號常染色體的短臂上,在人體位于4p15.1-p15.3,有13個外顯子,第1個為非編碼外顯子,其余為編碼外顯子,針對所有編碼外顯子設(shè)計引物進行PCR擴增。擴增片段包括外顯子及5’和3’兩側(cè)的部分內(nèi)含子序列。將PCR擴增產(chǎn)物交由北京華大基因有限公司進行測序,測序結(jié)果用BioEdit Sequence Alignment Editor I閱讀,在NCBI上進行BLAST比對。第三部分利用在CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢獲得的其中一名患者的肺組織標(biāo)本與正常肺組織標(biāo)本的對比,進行SLC34A2基因的功能研究。首先構(gòu)建SLC34A2基因真核表達載體,利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Not Ⅰ將SLC34A2基因插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,經(jīng)酶切鑒定及重組質(zhì)粒核苷酸測序分析,證實pcDNA3.1(+)-SLC34A2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。因SLC34A2基因編碼的Ⅱb型磷酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NaPi-Ⅱb),主要是在肺泡表面活性物質(zhì)代謝過程中參與磷酸鹽的轉(zhuǎn)運,因而選取了可以模擬正常Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌肺表面活性物質(zhì)的人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞進行轉(zhuǎn)染研究SLC34A2基因?qū)o機磷代謝的影響,通過Lipofectamine2000陽離子脂質(zhì)體包裹pcDNA3.1(+)-SLC34A2重組表達載體轉(zhuǎn)染入A549細胞進行表達,提取RNA、對重組質(zhì)粒進行RT-PCR鑒定,正常對照組和PAM組均在2000bp左右的位置出現(xiàn)基因擴增片段,與SLC34A2預(yù)期片段大小相符,證實了pcDNA3.1(+)-SLC34A2重組表達載體在A549細胞中得到完整表達。于成功轉(zhuǎn)染48小時以后,收集細胞培養(yǎng)上清,利用全自動生化分析儀檢測質(zhì)粒對照組、正常對照組、PAM組細胞培養(yǎng)上清中無機磷濃度。 結(jié)果 本研究一共在2個外顯子上發(fā)現(xiàn)了3處堿基改變。第1個是在對6號外顯子PCR擴增產(chǎn)物測序時在3名患者中均發(fā)現(xiàn)了(c.575CA)純合突變,從而使編碼的氨基酸由蘇氨酸變?yōu)橘嚢彼?p.T192K),屬于氨基酸替換。而在患者父母和子女的標(biāo)本中該位點測序結(jié)果均為雜合突變,患者的配偶和10名正常人的測序結(jié)果均正常,屬于表型-基因型共分離突變。第2個堿基改變是在對13號外顯子PCR擴增產(chǎn)物測序時在全部家庭成員(患者及其父母、子女、配偶)和一名健康受試者中均發(fā)現(xiàn)的c.1901AG純合SNP,在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中查到為rs6448389。本家系所有家庭成員及1名健康受試者均有c.1901AG,并未表現(xiàn)出表型-基因型共分離。第3個堿基改變同樣發(fā)生在13號外顯子上,是在患者及其父母還有其中1名子女的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的c.1962GA純合突變,在另外2名子女中為雜合突變,患者的配偶和正常人測序結(jié)果均正常。該突變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列和功能,屬于同義突變；且該突變在家系中的作用同樣未表現(xiàn)出表型-基因型共分離。在對質(zhì)粒對照組、正常對照組、PAM組細胞培養(yǎng)上清中無機磷濃度的檢測中,結(jié)果顯示正常對照組細胞上清中無機磷的濃度明顯下降,分別與質(zhì)粒對照組(P0.01)和PAM組(P0.01)相比,差異均有顯著性。PAM組細胞上清中無機磷的濃度略有下降,與質(zhì)粒對照組(P0.01)相比,差異均有顯著性。結(jié)果證實了第一步實驗中由于SLC34A2基因6號外顯子的c.575CA純合突變,使原來編碼的蘇氨酸變?yōu)橘嚢彼?導(dǎo)致NaPi-Ⅱb功能下降。 結(jié)論 該家系為一典型的常染色體隱性遺傳肺泡微石癥家系,隱匿起病,主要是在行常規(guī)胸部X線檢查時發(fā)現(xiàn)存在PAM。根據(jù)基因測序研究發(fā)現(xiàn)SLC34A2基因6號外顯子存在(c.575CA)純合突變,從而使編碼的氨基酸由蘇氨酸變?yōu)橘嚢彼?p.T192K),屬于表型-基因型共分離突變,也符合該家系的遺傳特點,故認為是本PAM家系致病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。通過構(gòu)建SLC34A2基因的真核表達載體,并轉(zhuǎn)染人肺泡上皮細胞中,對SLC34A2基因的功能進行研究發(fā)現(xiàn)由于6號外顯子(c.575CA)純合突變的發(fā)生,導(dǎo)致該家系PAM患者體內(nèi)由SLC34A2基因編碼的NaPi-Ⅱb蛋白功能下降,使其正常的磷酸鹽轉(zhuǎn)運功能受損,因而不能完全的從肺泡腔內(nèi)清理掉磷離子,使磷酸鹽在肺泡內(nèi)大量沉積,與鈣離子結(jié)合形成磷酸鈣(微結(jié)石),導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：肺泡微石癥 家系 SLC34A2基因
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-12
• 目錄12-13
• 英文縮寫詞表13-14
• 第1章 綜述14-32
• 第1部分 肺泡微石癥文獻回顧14-24
• 第2部分 SLC34A2基因的表達及影響因素24-32
• 第2章 PAM家系的遺傳特征、臨床特點32-40
• 家系病例調(diào)查32-36
• 臨床特點討論36-40
• 第3章 PAM家系致病基因的研究40-80
• 第1部分 PAM家系DNA的提取和突變位點的篩查41-57
• 材料與方法41-46
• 結(jié)果46-54
• 討論54-57
• 第2部分 PAM家系SLC34A2基因的功能研究57-80
• 第1節(jié) SLC34A2基因的真核表達載體的構(gòu)建57-68
• 材料和方法57-65
• 結(jié)果65-68
• 第2節(jié) SLC34A2基因轉(zhuǎn)染人上皮細胞對無機磷代謝的影響68-74
• 材料和方法68-73
• 結(jié)果73-74
• 討論74-80
• 結(jié)論80-82
• 參考文獻82-92
• 攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其成果92-94
• 致謝94

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本文編號：943351