本文關(guān)鍵詞：肺結(jié)核病血清生物學標志物的篩選、鑒定及FCN2 SNPs與肺結(jié)核病易感性研究

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【摘要】：第一部分基于iTRAQ2D LC-MS/MS技術(shù)篩選與鑒定肺結(jié)核病血清蛋白生物學標志物 研究背景：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的一種嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病,以肺結(jié)核病最為常見。結(jié)核分枝桿菌的致病性與細菌增殖引起的炎癥反應(yīng)、以及機體產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)損傷相關(guān)。盡管直接觀察與短程治療(DOTS)戰(zhàn)略的擴展及大量資金的投入,提高了治療完成率,但疾病的診斷仍然是全球結(jié)核病控制的主要障礙,結(jié)核病仍是發(fā)病率和死亡率最高的感染性疾病之一。疾病的早期診斷和及時治療對結(jié)核病的有效控制至關(guān)重要,是控制傳染源,遏制結(jié)核病流行的最重要措施。延誤診斷則導致疾病加重,增大死亡的風險,促進結(jié)核病的傳播。目前臨床上肺結(jié)核病的診斷方法有多種,但是鮮有改善結(jié)核病診斷的新技術(shù),使得結(jié)核病診斷方法陳舊。 機體感染結(jié)核分枝桿菌后,通過固有免疫和獲得性免疫抵御病原菌,在相互作用過程中可能會引起宿主機體的病理生理改變,可以通過檢測這種變化,尋找肺結(jié)核病的早期診斷方法。血清具有易獲得、非侵入性、對疾病的反應(yīng)快速等優(yōu)點,是疾病生物學標志物的理想來源。本課題將應(yīng)用iTRAQ標記結(jié)合2DLC-MS/MS技術(shù)篩選肺結(jié)核病與健康對照及肺部其他疾病血清中的差異表達蛋白,進一步應(yīng)用ELISA方法驗證差異表達蛋白,通過受試者工作曲線ROC分析潛在生物學標志物的準確性、靈敏性和特異性,為肺結(jié)核病的臨床診斷提供有意義的實驗數(shù)據(jù)。 研究方法：本研究收集血清樣本共160例,其中肺結(jié)核病組40例,健康對照組40例,鑒別診斷組(肺炎組40例,肺癌組40例)。應(yīng)用iTRAQ2D LC-MS/MS技術(shù)分析肺結(jié)核病與健康對照及肺部其他疾病血清中的蛋白,并通過Proteinpilot軟件鑒定與定量差異表達蛋白。應(yīng)用生物信息學分析顯著差異表達蛋白的細胞成分、分子功能和生物過程。應(yīng)用ELISA方法驗證差異表達的血清蛋白。應(yīng)用受試者工作曲線對各個蛋白診斷肺結(jié)核病的靈敏性、特異性和準確性進行比較和分析。 研究結(jié)果：本研究應(yīng)用iTRAQ2D LC-MS/MS技術(shù)檢測肺結(jié)核組與健康對照組及肺部其他疾病血清中的差異表達蛋白。在肺結(jié)核病血清中,共鑒定了434個蛋白質(zhì),篩選出34個蛋白(包括24個蛋白上調(diào)表達和10個蛋白下調(diào)表達)。經(jīng)ELISA分析發(fā)現(xiàn)有3個顯著差異表達的蛋白,即蛋白S100-A9(S100A9)、胞外超氧化物歧化酶(SOD3)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核組中MMP9的血清濃度分別與SOD3(r=0.581). S100A9(r=0.471)中度相關(guān),SOD3與S100A9弱相關(guān)(r=0.287)。應(yīng)用受試者工作曲線分析,S100A9. SOD3和MMP9組合鑒別肺結(jié)核病與健康對照的靈敏性和特異性為92.5%和95%,鑒別肺結(jié)核病與肺炎的靈敏性和特異性為90%和87.5%,鑒別肺結(jié)核病與肺癌的靈敏性和特異性為85%和92.5%。 結(jié)論：(1)建立iTRAQ2D LC-MS/MS結(jié)合ELISA檢測技術(shù)的肺結(jié)核病血清蛋白檢測技術(shù)平臺；(2)篩選出了3個顯著差異表達的蛋白,即S100A9、 SOD3和MMP9。 S100A9、 SOD3和MMP9組合鑒別肺結(jié)核與健康對照組及肺部其他疾病的靈敏性和特異性為85%和87.5%及以上,可以作為肺結(jié)核病的潛在生物學標志物,為肺結(jié)核病的臨床診斷提供了實驗依據(jù)。(3)篩選的其他顯著差異的蛋白,如Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein1(SNED1)、 L-lactate dehydrogenase A chain (LDHA)、 Filamin-A (FLNA)和Costars family protein C6orfll5(ABRACl)等由于研究背景、材料及商品化試劑盒的限制在本研究中沒有被驗證。對于這些蛋白的進一步研究可以幫助我們找到更多有效的肺結(jié)核病診斷標志物。 第二部分FCN2基因單核苷酸多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)性研究 研究背景：全球有三分之一的人群曾感染過結(jié)核分枝桿菌,約有5%-10%的人群最終發(fā)展成為活動性肺結(jié)核。本實驗室以往的研究發(fā)現(xiàn),基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與結(jié)核病易感性存在相關(guān)性,提示遺傳因素可能會影響個體對結(jié)核病的易感性。凝集素途徑是補體激活的一個重要途徑,在機體抵御病原菌感染過程中發(fā)揮重要作用。Ficolin-2凝集素是先天性免疫模式識別分子,能識別并結(jié)合多種病原菌,通過MBL-相關(guān)絲氨酸蛋白酶如MASP2激活補體途徑,在病原菌表面標記C3b,促進巨噬細胞吞噬病原菌,形成膜攻擊復合體并破壞其細胞膜,直接消滅病原菌。目前還沒有FCN2基因SNPs與肺結(jié)核病相關(guān)性的研究。本研究將進一步探索FCN2基因啟動子區(qū)和外顯子8區(qū)的7個SNPs位點與中國漢族人群肺結(jié)核病的相關(guān)性,為預防和控制肺結(jié)核病提供新的思路。 研究方法：應(yīng)用PCR擴增和DNA測序技術(shù),采用病例-對照方法,對中國漢族人群282例肺結(jié)核組和254例健康對照組血樣的FCN2基因啟動子區(qū)(-986GA、-602GA,-557AG、-64AC和-4AG)和外顯子8區(qū)(+6359CT和+6424GT)的7個SNPs位點基因型及等位基因頻率分布進行檢測。應(yīng)用邏輯回歸方法,在五種不同的遺傳模式下(共顯性、顯性、隱性、超顯性和加性)分析單個SNP與結(jié)核病的相關(guān)性。應(yīng)用SNPstats及Haploview4.2軟件對7個位點進行連鎖不平衡分析。 研究結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)FCN2基因7個SNPs位點的等位基因在肺結(jié)核組與健康對照組之間的分布頻率沒有顯著性差異。然而,變異純合基因型(P=O.037.-557AG；P:0.038,-64AC；P=O.024,+6424GT)在肺結(jié)核病組的分布頻率低于健康組,在兩組之間存在顯著性差異。經(jīng)年齡和性別校正后,一557AG(P=O.019:OR=0.24；95％CI,0.07一0.89),.64AC(P=0.019；OR=0.24；95％CI,0.07-0.89)和+6424GT(P=0.012；OR=0.23；95％CI,0.06.0.82)位點在隱性模式下與肺結(jié)核病存在顯著相關(guān)性。另外,.64AC(P=0.047)和+6424GT(P=O.03)在共顯性模式下與肺結(jié)核病也存在顯著相關(guān)性。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn),除-602GA位點以外,其余6個位點之間均存在強連鎖關(guān)系(D'＞0.75,P0.0001)。另外,構(gòu)建的單體型與肺結(jié)核病均不存在顯著相關(guān)性。因此FCN2基因的.557AG..64AC和+6424GT位點與肺結(jié)核病存在相關(guān)性,可能為肺結(jié)核病的保護性因素。 結(jié)論：(1)采用病例-對照方法及統(tǒng)計學分析,首次對FCN2基因啟動子區(qū)及外顯子區(qū)8的7個SNPs位點與肺結(jié)核病的易感性進行關(guān)聯(lián)研究。(2)FCN2基因的.557AG、64AC和+6424GT位點的變異純合型可能為肺結(jié)核病的保護性因素,在隱性模式下與肺結(jié)核病顯著相關(guān)。-64AC和+6424GT位點在共顯性模式下也與肺結(jié)核病顯著相關(guān)。(3)FCN2基因的.986GA、602GA、-4AG和+6359CT的SNPs與中國南方漢族人群肺結(jié)核病均不存在顯著的相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：肺結(jié)核病 潛在生物學標志物 ITRAQ2D LC-MS/MS 肺結(jié)核 FCN2基因 病例-對照研究 單核苷酸多態(tài)性
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R521
【目錄】：

• 致謝5-6
• 課題基金資助情況6-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 英文縮略語16-20
• 第一部分 基于iTRAQ 2D LC-MS/MS技術(shù)篩選與鑒定肺結(jié)核病血清蛋白生物學標志物20-56
• 1 前言20-26
• 2 材料26-31
• 3 方法31-37
• 4 結(jié)果37-48
• 5 討論48-55
• 6 結(jié)論55-56
• 第二部分 FCN2基因單核苷酸多態(tài)性與肺結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)性研究56-88
• 7 前言56-61
• 8 材料61-64
• 9 方法64-71
• 10 結(jié)果71-83
• 11 討論83-87
• 12 結(jié)論87-88
• 參考文獻88-101
• 綜述101-114
• 參考文獻110-114
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果114-116
• 附件116-12

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組;第四次全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2002年01期

2 Yushan Ren;Quanquan Ding;Xiaolian Zhang;;Ficolins and infectious diseases[J];Virologica Sinica;2014年01期

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本文編號：895463