本文關(guān)鍵詞：HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療閉塞性細(xì)支氣管炎的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：同種異體移植已經(jīng)成為血液系統(tǒng)惡性病的主要治療方法,盡管新的治療方法和免疫抑制劑的使用對于感染并發(fā)癥有很好的控制作用,但肺部并發(fā)癥仍是造血干細(xì)胞移植后發(fā)病率和死亡率高的主要原因。閉塞性細(xì)支氣管炎(Bronchiolitis obliterans syndrome,BOS)是一種嚴(yán)重的、非感染性的、致命的肺部并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制可能與慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)相關(guān),目前尚無有效治療手段,因此,研發(fā)新的治療策略具有重要意義。近年的研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一種多功能生長因子。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型中,通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-1(Transformating growth factor-beta1,TGF-β1)的分泌,發(fā)揮抗纖維化、抗炎的作用,調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,減少纖維蛋白的沉積。但是,HGF蛋白的半衰期短,需要多次給藥,靜脈給藥不能大量進(jìn)入肺組織,因而不能更好地發(fā)揮效能。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)作為一種多能干細(xì)胞,不僅具有免疫調(diào)節(jié)和多向分化潛能,還具有相對的定位歸巢作用,容易歸巢到炎癥、損傷部位。本課題組前期試驗(yàn)證實(shí)重組腺病毒-肝細(xì)胞生長因子(Recombinant adenovirus with HGF,Ad-HGF)修飾可使人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical Cord Mesenchymal stem cells,UCMSC)可高表達(dá)HGF,延長UCMSC在小鼠體內(nèi)存活時(shí)間,增強(qiáng)UCMSC的免疫調(diào)節(jié)作用,有效治療放射性肺損傷和腸損傷�；蛐揎椀母杉�(xì)胞因具有干細(xì)胞治療和基因治療的雙重優(yōu)勢,在基因生物治療領(lǐng)域已得到廣泛的認(rèn)同及關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用HGF基因修飾的UCMSC治療閉塞性細(xì)支氣管炎,觀察移植氣管病理學(xué)變化,計(jì)算移植氣管的阻塞率,評估HGF基因修飾的UCMSC對防治閉塞性細(xì)支氣管炎的療效,通過檢測移植氣管組織及血清中炎性因子的表達(dá)、脾臟中淋巴細(xì)胞表型的變化來研究基因修飾細(xì)胞的作用機(jī)制。首先,按hertz等人建立的方法建立了小鼠異位氣管移植模型。為評價(jià)msc在bos小鼠體內(nèi)的定植分布情況,我們分離、培養(yǎng)及鑒定egfp轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mousebonemarrowmesenchymalstemcells,bmsc)后,建立異種氣管異位移植的bos小鼠模型。待小鼠蘇醒后,通過尾靜脈輸注經(jīng)150moiad-null或ad-hgf感染的mbmsc(1×106細(xì)胞/200μl),在注射后不同的時(shí)間點(diǎn),眼球取血,對移植氣管、重要臟器進(jìn)行取材并提取基因組dna,通過實(shí)時(shí)定量pcr(real-timequantitativepcr,q-pcr)的方法檢測egfp基因在bos小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。將經(jīng)150moiad-null或ad-hgf感染的ucmsc細(xì)胞作為治療用細(xì)胞,經(jīng)尾靜脈輸注于bos模型鼠(1×106細(xì)胞/200μl),對照組輸注200μl生理鹽水(normalsaline,ns),通過設(shè)立不同時(shí)間點(diǎn)及組別,收集移植氣管固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片、he染色,觀察移植氣管纖維結(jié)締組織的增生及炎性細(xì)胞浸潤等病理形態(tài)變化,從而評價(jià)ucmsc對小鼠bos的治療作用及hgf基因修飾對療效的影響。此外,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)和q-pcr的方法,檢測了血液及移植局部炎癥因子及抗炎因子的表達(dá),通過流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟淋巴細(xì)胞表型改變。研究結(jié)果表明,bmsc移植后可以歸巢并定植于移植氣管損傷局部、血液、肝臟、肺等組織器官,hgf基因修飾可以促進(jìn)bmsc的定植并延長其定植時(shí)間。mscs-hgf及mscs-null治療可以明顯減輕移植氣管內(nèi)纖維結(jié)締組織的增生、上皮細(xì)胞的壞死、脫落、缺失、炎細(xì)胞的浸潤、氣管環(huán)的破壞等bos典型的病理變化,hgf基因修飾組作用優(yōu)于mscs-null組。mscs-hgf治療后炎性細(xì)胞因子γ-干擾素(gamainterferon,ifn-?)表達(dá)降低,抗炎細(xì)胞因子白介素-4(interleukin4,il-4)和白介素-10(interleukin10,il-10)的表達(dá)升高,同時(shí)促纖維化因子tgf-?1的表達(dá)水平降低。此外,細(xì)胞治療后降低了由氣管移植所誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞treg,th1/th2,th17的升高趨勢,細(xì)胞免疫表型改變明顯改善。上述研究表明,HGF修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以防止氣管移植相關(guān)的氣道纖維增生性病變,可通過調(diào)節(jié)炎癥及纖維化的進(jìn)程而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)為HGF基因修飾UCMSC的臨床轉(zhuǎn)化提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為BOS提供了新的治療策略。
【關(guān)鍵詞】：閉塞性細(xì)支氣管炎 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 肝細(xì)胞生長因子 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 輔助性T淋巴細(xì)胞 造血干細(xì)胞移植
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R562.21
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-32
• 結(jié)果32-35
• 附圖35-43
• 附表43-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 綜述54-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 致謝64-65
• 個(gè)人簡歷65-66

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本文編號：891879