本文關(guān)鍵詞：氣道酸性微環(huán)境對(duì)氣道上皮緊密連接的影響及其分子機(jī)制

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【摘要】：目的： 研究諸多肺部慢性炎癥性疾病狀態(tài)下氣道酸性微環(huán)境對(duì)氣道上皮緊密連接（Tight Junction, TJ）形成的影響，探討其中的分子鏈接機(jī)制。從而為理解病理狀態(tài)下，酸性氣道微環(huán)境對(duì)氣道上皮物理屏障功能的影響；詮釋其中的分子機(jī)制，提供理論基礎(chǔ)。 方法： （1）明確酸性刺激對(duì)氣道上皮細(xì)胞TJ的影響 體外培養(yǎng)永生化人支氣管上皮細(xì)胞株（16HBE），使用Western Blot法檢測(cè)氣道上皮主要緊密連接蛋白的表達(dá)情況。使用不同酸度的培養(yǎng)基刺激模擬病理狀態(tài)下氣道酸性微環(huán)境，使用跨皮細(xì)胞組抗儀檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞層的跨皮細(xì)胞阻抗（Trans-epithelium electrical resistant,TER），運(yùn)用辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase, HRP）流量法反應(yīng)上皮細(xì)胞的通透性；通過Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞TJ蛋白家族總量的變化情況，通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)氣道上皮TJ蛋白家族的細(xì)胞分布情況。 （2）明確酸性刺激下，氣道上皮物理屏障/通透屬性平衡態(tài)失調(diào)的分子鏈接機(jī)制 構(gòu)建瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道V1（transient receptor potentialcation channel subfamily V member1, TRPV1）短發(fā)夾RNA（short hairpinRNA, shRNA），通過轉(zhuǎn)染篩選TRPV1缺陷的16HBE細(xì)胞株；運(yùn)用TRPV1抑制劑capsazepine，細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM，PKC抑制劑Safingol，Calpain蛋白酶抑制劑MDL28170等信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)阻斷劑進(jìn)行干預(yù)，探討酸性微環(huán)境影響人氣道上皮TJs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 結(jié)果： （1）酸性微環(huán)境誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞株16HBE物理屏障功能減退，并在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間-濃度依賴性 使用不同濃度的酸性培養(yǎng)基可影響人氣道上皮細(xì)胞層的TER。pH6.0酸性刺激可輕微增高氣道上皮細(xì)胞TER值，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；pH低于6.0的酸性培養(yǎng)基刺激可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞系（16HBE）TER值的下降，并呈時(shí)間、濃度依賴性。pH5.0的酸性培養(yǎng)基刺激8h，可使16HBE細(xì)胞層的TER值下降約61.0±6.6%；pH4.0的酸性培養(yǎng)基刺激8h，可使16HBE細(xì)胞TER值下降約52.9±6.7%。運(yùn)用HRP流量法檢測(cè)酸性刺激下16HBE細(xì)胞層的通透性變化，16HBE細(xì)胞通透性依賴于酸性刺激的強(qiáng)度與時(shí)間，在pH5.0的酸性刺激下，16HBE細(xì)胞通透性開始出現(xiàn)升高。pH5.0的酸性培養(yǎng)基刺激8h，可使16HBE細(xì)胞層HRP流量值增為對(duì)照組的（4.1±0.4）倍，pH4.0刺激可誘導(dǎo)HRP流量值增為對(duì)照組的（4.9±0.5）倍。 （2）酸性微環(huán)境誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞株16HBE中Claudin-3、Claudin-4胞膜錨定蛋白部分降解 使用Western Blot法檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞16HBE膜提取物中TJ蛋白家族在酸性刺激下的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，酸化培養(yǎng)基（pH5.0）可明顯下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Claudin-3與Claudin-4的表達(dá)，但不影響氣道上皮TJ蛋白家族成員Occludin、Claudin-1、Claudin-5、Claudin-7及ZO-1的表達(dá)量。進(jìn)一步使用細(xì)胞免疫熒光共聚焦法顯示在酸化培養(yǎng)液刺激下，16HBE細(xì)胞銜接處Claudin-3、Claudin-4量顯著降低。 （3）酸性微環(huán)境誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞株16HBE中Claudin-3、Claudin-4胞膜錨定蛋白部分降解及物理屏障/通透屬性失調(diào)可能通過TRPV1-[Ca2+]i-PKCα信號(hào)鏈激活Calpain蛋白酶系統(tǒng)所實(shí)現(xiàn) 使用TRPV1特異性shRNA下調(diào)TRPV1的表達(dá)，構(gòu)建TRPV1缺陷的16HBE細(xì)胞株；分別運(yùn)用TRPV1離子通道抑制劑capsazepine，細(xì)胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM、PKC選擇性抑制劑Safingol或使用需鈣蛋白酶calpain抑制劑MDL28170預(yù)處理16HBE細(xì)胞，通過阻斷TRPV1-[Ca2+]i-PKC-Calpain信號(hào)鏈可部分抑制酸性刺激下膜錨定蛋白Claudin-3，Claudin-4的降解與重分布，減輕酸性培養(yǎng)下16HBE細(xì)胞層TER值的下降與通透性的升高。 結(jié)論： （1）酸性氣道微環(huán)境可通過誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞TJ蛋白家族Claudin-3及Claudin-4的改變，，引起氣道上皮細(xì)胞物理屏障/通透屬性平衡態(tài)失調(diào)。 （2）酸性刺激主要為通過TRPV1-[Ca2+]i-PKC信號(hào)鏈激活鈣調(diào)蛋白酶Calpain，誘導(dǎo)細(xì)胞間連接處Claudin-3、Claudin-4的降解，從而引起氣道粘膜物理屏障功能減損。
【關(guān)鍵詞】：酸性 氣道上皮 緊密連接
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R56
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 摘要7-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-22
• 參考文獻(xiàn)18-22
• 第一部分 氣道酸性微環(huán)境對(duì)氣道上皮緊密連接的影響22-45
• 1 材料和設(shè)備22-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-31
• 3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-35
• 5 討論35-37
• 6 小結(jié)37-38
• 附圖38-44
• 參考文獻(xiàn)44-45
• 第二部分：氣道酸性微環(huán)境損傷氣道上皮 TJ 的分子鏈接機(jī)制45-74
• 1 材料和方法45
• 2 實(shí)驗(yàn)方法45-54
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-58
• 4 討論58-63
• 附圖63-71
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 全文總結(jié)74-75
• 文獻(xiàn)綜述75-96
• 參考文獻(xiàn)88-96
• 致謝96-97
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄97-98

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