地龍?zhí)崛∥餃p弱矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化機(jī)制研究
發(fā)布時(shí)間：2017-09-13 04:11
本文關(guān)鍵詞：地龍?zhí)崛∥餃p弱矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化機(jī)制研究
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【摘要】：矽肺是由于長(zhǎng)期吸入游離二氧化硅(silicon dioxide,SiO_2)粉塵所致的以進(jìn)行性、結(jié)節(jié)性纖維化及彌漫性肺間質(zhì)纖維化為主的疾病,是塵肺中最常見、進(jìn)展最快、危害最嚴(yán)重的一種類型。在我國(guó),矽肺是發(fā)病率最高的職業(yè)病之一,目前,我國(guó)矽肺的發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì),中國(guó)衛(wèi)生部的職業(yè)病報(bào)告數(shù)據(jù)顯示,2014年新診斷塵肺病26873例,占所有報(bào)告職業(yè)病的89.66%,其中11471例(42.69%)為矽肺。由于矽肺發(fā)病機(jī)制仍然不完全清楚,迄今無(wú)特效治愈方法。隨著對(duì)肺纖維化發(fā)生機(jī)制研究的不斷深入,越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激在肺纖維化疾病(包括矽肺)的發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用。外源的活性氧化劑以及那些在炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞里內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)均可造成機(jī)體的氧化應(yīng)激。在肺纖維化中,氧化應(yīng)激可導(dǎo)致異常的上皮細(xì)胞損傷反應(yīng),包括細(xì)胞因子表達(dá)增多、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、上皮細(xì)胞凋亡等。機(jī)體內(nèi)除氧化系統(tǒng)外,還存在著由各種抗氧化酶類和抗氧化劑等組成的抗氧化防御系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是調(diào)節(jié)這些抗氧化基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。地龍是一種眾所周知的傳統(tǒng)中藥,并且作為功能性的食物成分已被用來治療疾病以及促進(jìn)健康,其提取物(earthworm extract,EE)的主要活性成分為蚓激酶,含有膠原酶、纖溶酶、纖溶酶原激活物等,以降低血液黏稠度、減少血小板聚集、改善微循環(huán)、體內(nèi)外良好的溶栓抗凝作用而廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。除了抗凝和纖溶活性,地龍?zhí)崛∥镞�有多種生物學(xué)功能,包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等,從而可能為肺纖維化提供保護(hù)作用。我們課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明,EE減弱了Si02誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥及纖維化,改善了肺組織結(jié)構(gòu)和功能。為了探討EE減弱矽肺纖維化的作用機(jī)制,我們利用小鼠矽肺體內(nèi)模型及支氣管與肺泡上皮細(xì)胞(HBE和A549)染塵體外模型,研究EE對(duì)Si02誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、上皮細(xì)胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。目的建立Si02誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化體內(nèi)模型,構(gòu)建HBE和A549細(xì)胞染塵體外模型,探討EE減弱矽肺纖維化的作用機(jī)制,為EE在矽肺上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),進(jìn)而擴(kuò)大EE的臨床應(yīng)用范圍,為矽肺的防治提供有效的新藥物。方法(1)建立Si02誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型,設(shè)立生理鹽水組、矽塵組、EE干預(yù)組3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。(2)利用HBE和A549細(xì)胞建立染塵體外模型,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作為陽(yáng)性對(duì)照,CCK8法篩選SiO_2、EE、NAC的作用劑量和時(shí)間,評(píng)價(jià)EE對(duì)Si02誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的改善作用。(3)Hoechst 33258染色體外觀察EE對(duì)SiO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。(4)JC-1染色檢測(cè)線粒體膜勢(shì)能水平,熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平,評(píng)價(jià)EE對(duì)Si02誘導(dǎo)的線粒體損傷的影響。(5)免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c的表達(dá)及分布,Western blot檢測(cè)肺組織及細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,分析EE對(duì)Si02活化的線粒體凋亡通路的影響。(6)Western blot檢測(cè)肺組織及細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物及細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)水平,分析EE對(duì)Si02誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。(7)DCFH-DA探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)水平,試劑盒檢測(cè)血清及細(xì)胞內(nèi)TSOD、MDA、GSH水平,評(píng)價(jià)EE對(duì)Si02誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響。(8)Western blot檢測(cè)肺組織及細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)水平,免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)及分布,qRT-PCR檢測(cè)肺組織及細(xì)胞內(nèi)NQO-1和HO-1的mRNA水平,分析EE對(duì)Nrf2通路的活化作用。(9) Nrf2-siRNA干涉Nrf2的表達(dá)后,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性,DCFH-DA探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)水平,JC-1染色檢測(cè)線粒體膜勢(shì)能水平,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平,分析Nrf2在EE保護(hù)Si02誘導(dǎo)的肺纖維化中的作用。(10)數(shù)據(jù)以來自3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,由Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行處理。多組計(jì)量資料的比較應(yīng)用單因素方差分析及事后比較；兩組計(jì)量資料的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SPSS 20.0軟件用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1.CCK8結(jié)果顯示,SiO_2以劑量和時(shí)間依賴的方式顯著抑制了HBE和A549細(xì)胞的活性。200μg/ml SiO_2處理24小時(shí)使HBE和A549細(xì)胞活性降低至50%左右,因而作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理?xiàng)l件。1和2 U/μl的EE以及0.1和1mM的NAC明顯增強(qiáng)了HBE和A549的細(xì)胞活性,因而作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件。2. Hoechst 33258結(jié)果顯示,在HBE和A549細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,Si02處理導(dǎo)致了凋亡細(xì)胞數(shù)量的顯著增加,而EE或NAC干預(yù)明顯抑制了細(xì)胞凋亡。3.線粒體熒光染料JC-1染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Si02刺激HBE和A549細(xì)胞導(dǎo)致線粒體膜勢(shì)能下降；然而EE或NAC干預(yù)抑制了線粒體膜勢(shì)能的破壞。SiO_2處理組細(xì)胞內(nèi)ATP含量較對(duì)照組明顯降低,而EE或NAC干預(yù)恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)ATP水平。4.免疫熒光結(jié)果顯示,Si02誘導(dǎo)了細(xì)胞色素c從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì),而EE或NAC干預(yù)阻止了細(xì)胞色素c的釋放。Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Si02處理組HBE和A549細(xì)胞及肺組織內(nèi)細(xì)胞色素c、cleaved-caspase 9、 cleaved-caspase 3、 Bax蛋白表達(dá)水平顯著增加,Bcl-2蛋白水平明顯降低,但EE干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這些變化。5. Western blot結(jié)果顯示,在HBE和A549細(xì)胞及肺組織內(nèi),與對(duì)照組相比,Si02處理顯著增加了TGF-β1、IL-1β、pPAI-1的蛋白水平,而EE干預(yù)明顯減少了細(xì)胞因子的表達(dá)。并且,Si02處理顯著減少了E-鈣粘素的蛋白水平而增加了α-SMA的表達(dá),EE干預(yù)則抑制了EMT。6. DCFH-DA試驗(yàn)結(jié)果顯示,在HBE和A549細(xì)胞內(nèi),SiO_2刺激顯著升高了活性氧類物質(zhì)水平至對(duì)照組的3倍左右,而EE或NAC干預(yù)明顯抑制了活性氧類物質(zhì)水平的增加。并且,Si02刺激顯著降低了HBE和A549細(xì)胞及血清中TSOD活性及GSH/GSSG水平并升高了MDA含量,而EE干預(yù)明顯增高了TSOD活性并減少了MDA含量。7. Western blot結(jié)果顯示,在HBE和A549細(xì)胞及肺組織內(nèi),Si02增加了Nrf2的蛋白水平,而EE干預(yù)后進(jìn)一步增加了Nrf2的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示,在HBE和A549細(xì)胞內(nèi),EE促進(jìn)了Nrf2的核轉(zhuǎn)位。在HBE和A549細(xì)胞及肺組織中,Si02刺激上調(diào)了NQO-1和HO-1的mRNA水平,EE干預(yù)后又進(jìn)一步增加了NQO-1和HO-1的mRNA水平。8.在HBE和A549細(xì)胞內(nèi),Nrf2 siRNA有效地下調(diào)了Nrf2的表達(dá),在野生型細(xì)胞中,EE (2 U/μl)干預(yù)明顯抑制了SiO_2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、活性氧類物質(zhì)升高、線粒體膜勢(shì)能降低、線粒體凋亡通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。而在Nrf2基因沉默細(xì)胞中,EE并不能抑制SiO_2誘導(dǎo)的纖維化反應(yīng)。結(jié)論機(jī)制研究提示EE可能通過激活Nrf2通路,減弱SiO_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,進(jìn)而抑制上皮細(xì)胞線粒體凋亡通路及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,最終干預(yù)矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：地龍?zhí)崛∥?/strong> 矽肺 Nrf2 線粒體凋亡通路 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R135.2
【目錄】：
- 縮略語(yǔ)5-7
- 中文摘要7-11
- 英文摘要11-16
- 前言16-20
- 材料與方法20-37
- 結(jié)果37-55
- 討論55-59
- 結(jié)論59-60
- 參考文獻(xiàn)60-69
- 綜述69-87
- 參考文獻(xiàn)78-87
- 附錄87-88
- 碩士期間發(fā)表論文88-89
- 致謝89
【參考文獻(xiàn)】
中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條
1 劉麗芳;文秀英;許明旺;劉浩;陳愛萍;張泓;黃文凡;熊亮;;貞清方與地龍對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織TGF-β_1及PAI-1表達(dá)的影響[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志;2011年07期
2 齊杰;劉艷超;李清君;陳曉玲;;銀杏葉提取物對(duì)大鼠肺纖維化的影響及其機(jī)制的研究[J];中國(guó)中藥雜志;2010年22期
，本文編號(hào)：841433
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