本文關(guān)鍵詞：Notch信號通路調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá)Col1α1及Col1α2從而影響哮喘氣道上皮下纖維化

  更多相關(guān)文章： 哮喘 Notch Col1α1 Col1α2 成纖維細(xì)胞 上皮下纖維化

【摘要】：支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道高反應(yīng)性及氣道重塑是其主要的兩大特征，而氣道上皮下纖維化又是氣道重塑的核心，是重癥哮喘患者死亡的主要原因之一。大量成纖維細(xì)胞在氣道上皮下聚集以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積導(dǎo)致了氣道上皮下纖維化。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是I型膠原蛋白。I型膠原蛋白是由2個alpha1和1個alpha2膠原蛋白分子組成的異三聚體，呈螺旋結(jié)構(gòu)，分別由COL1A1及COL1A2基因編碼。成纖維細(xì)胞是合成I型膠原蛋白的主要細(xì)胞。迄今為止，沒有直接針對氣道上皮下纖維化的有效的治療方法。因此尋找探索其形成機(jī)制和阻斷辦法具有重要的理論和實(shí)際意義。Notch信號通路在進(jìn)化上高度保守，它由Notch受體、配體及其下游分子組成，通過相鄰的細(xì)胞之間受體和配體的相互作用而傳遞生物信息，對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用，影響著生命體的生長和發(fā)育。在哺乳動物Notch通路由4種Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、5種Notch配體（Jagged1、Jagged2；Delta1、Delta3、Delta4）、細(xì)胞核內(nèi)蛋白效應(yīng)器（CSL：CBFl/Suppresor of Hairless/Lag1分別指哺乳動物、果蠅、線蟲中的名稱等）以及Notch下游靶基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子Hes1等蛋白分子組成。Notch胞內(nèi)段（Notchintracellular domain，，NICD）是Notch信號通路的活性片段，在Notch受體與配體結(jié)合時，由γ-分泌酶從細(xì)胞膜水解出來，并遷移到細(xì)胞核內(nèi)，與Notch的下游效應(yīng)蛋白CSL結(jié)合，從而激活Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄，Notch下游靶基因多為堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族，激活后編碼Hes1等轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化等。目前有關(guān)Notch信號通路與疾病關(guān)系的研究已成為疾病研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。研究表明Notch信號通路對胚胎期肺的生長、發(fā)育，對肺癌、哮喘等疾患的發(fā)生、發(fā)展具有調(diào)控作用。有關(guān)Notch與纖維化的研究進(jìn)一步表明，Notch信號通路對肺臟、腎臟、肝臟、心肌及系統(tǒng)性硬化病等的纖維化形成具有重要影響。目前認(rèn)為氣道上皮下纖維化是氣道上皮基底膜下網(wǎng)狀板層的增厚，且最終導(dǎo)致基底膜增厚。氣道粘膜上皮基底膜下網(wǎng)狀板層在胚胎期并不存在，隨著發(fā)育而逐漸出現(xiàn)。在哮喘個體由于成纖維細(xì)胞聚集和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積使該層明顯增厚最終導(dǎo)致上皮下纖維化。這種纖維化是否也象上述臟器纖維化一樣受到Notch信號調(diào)控，調(diào)控基質(zhì)產(chǎn)生的分子機(jī)制如何尚未見報道。由于Col1α1及Col1α2是哮喘上皮下纖維化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，我們針對人和鼠的膠原蛋白編碼基因COL1A1及COL1A2的啟動子進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)COL1A1及COL1A2啟動子上游及附近均有Notch信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子Hes1的結(jié)合位點(diǎn)即N-box位點(diǎn)（CACNAG）。由此，我們提出這樣的假設(shè)：哮喘狀態(tài)時，Notch信號通路通過Hes1依賴方式調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá)Col1α1及Col1α2，從而調(diào)控氣道上皮下纖維化。為驗(yàn)證這個假設(shè)我們進(jìn)行了以下研究： 實(shí)驗(yàn)方法： 1.用實(shí)時熒光定量PCR（Real-time PCR）和Western blotting方法從mRNA和蛋白水平檢測小鼠成纖維細(xì)胞L929、人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5及小鼠肺上皮細(xì)胞CMT64等三個細(xì)胞系的Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、配體（Jagged1、Jagged2；Delta1、Delta3、Delta4）及下游關(guān)鍵靶因子Hes1的表達(dá)情況。 2.通過上調(diào)和下調(diào)Notch信號通路，分別用Real-time PCR和Western blotting方法在mRNA和蛋白水平檢測小鼠L929及人MRC-5細(xì)胞系Col1α1及Col1α2表達(dá)水平的變化。 3.通過小鼠和人的COL1A1及COL1A2啟動子螢光素酶（Luciferase）報告基因?qū)嶒?yàn)、小鼠和人的COL1A1及COL1A2N-box位點(diǎn)突變后的啟動子Luciferase報告基因?qū)嶒?yàn)、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)及DNA-Pull down實(shí)驗(yàn)，觀察Notch信號通路對小鼠和人COL1A1及COL1A2啟動子活性的直接影響，以及Hes1在Notch信號通路調(diào)節(jié)COL1A1及COL1A2啟動子活性中的作用。 4.建立小鼠哮喘模型，檢測雞卵清蛋白（ovalbumin, OVA）誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠及其對照小鼠肺組織中Notch通路各分子表達(dá)情況。 5.用Notch信號通路抑制劑KyoT2重組腺病毒表達(dá)載體滴鼻觀察小鼠肺內(nèi)Hes1的表達(dá)情況。 6.用Notch信號通路抑制劑KyoT2重組腺病毒表達(dá)載體滴鼻干預(yù)OVA誘導(dǎo)哮喘模型小鼠，觀察KyoT2對哮喘模型小鼠氣道上皮下纖維化和氣道高反應(yīng)的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.在L929、MRC-5及CMT64細(xì)胞中，Notch各分子的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，但Notch1, Hes1作為Notch通路關(guān)鍵的分子在三種細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)。 2.在轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor β1, TGF-β1）存在的情況下Notch的活性段NICD能上調(diào)Col1α1及Col1α2在小鼠L929及人MRC-5細(xì)胞中的表達(dá)。Notch的抑制劑γ-分泌酶抑制劑（N-3,5-difluorophenyl acetyl-L-alanyl-2-phenylglycin-1,1-dimethylethyl ester, DAPT）能下調(diào)Col1α1及Col1α2在小鼠L929及人MRC-5細(xì)胞中的表達(dá)。 3. COL1A1及COL1A2啟動子的活性呈NICD濃度依賴性，其Hes1的結(jié)合位點(diǎn)N-box位點(diǎn)突變后NICD對COL1A1及COL1A2的活性無影響。 4. Hes1蛋白抗體能將小鼠L929及人MRC-5細(xì)胞COL1A1及COL1A2啟動子DNA沉淀下來；含N-box位點(diǎn)的COL1A1及COL1A2啟動子能從L929及人MRC-5核蛋白提取物中將Hes1蛋白沉淀下來。 5.在OVA誘導(dǎo)的慢性哮喘模型小鼠及對照小鼠中Notch各分子的表達(dá)也不同，與對照小鼠比較哮喘模型鼠的Notch1、Notch2、Notch4、Jagged1、Jagged2、Delta4、Hes1均明顯上升，Notch3、Delta1、Delta3的表達(dá)卻下降。 6. OVA誘導(dǎo)的哮喘模型鼠氣道重塑各項(xiàng)指標(biāo)，如膠原沉積、上皮下纖維化、基底膜增厚、氣道平滑肌增生等較對照小鼠明顯，其中膠原沉積及上皮下纖維化猶為顯著。 7. KyoT2能下調(diào)小鼠肺組織Hes1的表達(dá)，減輕OVA誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠氣道上皮下膠原沉積、減輕基底膜的增厚；此外，還可抑制哮喘氣道平滑肌增生等氣道重塑現(xiàn)象。 8. KyoT2抑制了OVA誘導(dǎo)哮喘模型小鼠的氣道高反應(yīng)性。 綜合上述，本課題得出的結(jié)論為： 1. Notch信號通路以Hes1依賴方式直接調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá)Col1α1和Col1α2。 2. Hes1在Notch信號通路調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá)Col1α1和Col1α2時從傳統(tǒng)的具有負(fù)性調(diào)節(jié)特征的因子轉(zhuǎn)換為具有正性調(diào)節(jié)特征的因子。 3.抑制Notch信號通路能改善哮喘小鼠氣道上皮下纖維化，降低氣道高反應(yīng)，可能成為治療哮喘的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：哮喘 Notch Col1α1 Col1α2 成纖維細(xì)胞 上皮下纖維化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 縮略語表4-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-17
• 前言17-18
• 文獻(xiàn)回顧18-29
• 1. 支氣管哮喘與氣道重塑18-19
• 2. 氣道上皮下纖維化是哮喘氣道重塑的重要特征19-21
• 3. Notch 信號通路21-23
• 4. Notch 信號通路對肺的發(fā)育及肺疾病的影響23-24
• 5. Notch 信號通路與組織器官的纖維化24-25
• 6. Notch/Hes1 軸25-26
• 7. GSI 與 Notch26
• 8. KyoT2 與 Notch26-27
• 9. 研究 Notch 信號通路與哮喘氣道上皮下纖維化的關(guān)系的意義27-29
• 第一部分 Notch 信號通路各分子在成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞中的表達(dá)研究29-46
• 引言29
• 1. 材料29-31
• 2. 方法31-37
• 3. 結(jié)果37-43
• 4. 討論43-46
• 第二部分 Notch 信號通路調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá) Col1α1 及 Col1α2 的功能研究46-56
• 引言46
• 1. 材料46-47
• 2. 方法47-51
• 3. 結(jié)果51-53
• 4. 討論53-56
• 第三部分 Notch 信號通路調(diào)控成纖維細(xì)胞表達(dá) Col1α1 及 Col1α2 的機(jī)制研究56-69
• 引言56
• 1. 材料56-58
• 2. 方法58-63
• 3. 結(jié)果63-66
• 4. 討論66-69
• 第四部分 Notch 信號通路對哮喘氣道上皮下纖維化的調(diào)節(jié)作用研究69-102
• 引言69
• 1. 材料69-71
• 2. 方法71-79
• 3. 結(jié)果79-98
• 4. 討論98-102
• 小結(jié)102-104
• 參考文獻(xiàn)104-118
• 個人簡歷和研究成果118-119
• 致謝119

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