本文關(guān)鍵詞：呼吸道上皮細(xì)胞氣液界面培養(yǎng)的研究

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【摘要】：呼吸道上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)對離體研究呼吸道的生理功能,呼吸道疾病的致病機(jī)制以及診療都具有重要意義。氣液界面培養(yǎng)技術(shù)(air-liquid interface,ALI)是一種將氣管、鼻息肉等呼吸道組織上的原代上皮細(xì)胞分離后,經(jīng)傳代擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量后,再接種到預(yù)包被膠原的0.4umTranswell培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng),該培養(yǎng)皿的下層加入分化培養(yǎng)基,而培養(yǎng)皿中的細(xì)胞上層則暴露于空氣。經(jīng)過一段時(shí)間的ALI培養(yǎng)后,上皮細(xì)胞經(jīng)過分化后就能產(chǎn)生纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基細(xì)胞等多種細(xì)胞,并由細(xì)胞分泌的粘液覆蓋,產(chǎn)生類似于體內(nèi)生理結(jié)構(gòu)和功能的假復(fù)層纖毛柱狀上皮組織。目前病毒體外培養(yǎng)和增殖方法主要是應(yīng)用普通的細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚和動(dòng)物模型。動(dòng)物模型難以篩選和構(gòu)建,費(fèi)時(shí)耗力而且涉及各種倫理因素,而雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)是一種既方便又有效的病毒培養(yǎng)分離方法。但雞胚培養(yǎng)僅限于有限的病毒種類的培養(yǎng)和擴(kuò)增,難以開展病毒生物學(xué)特性及致病機(jī)制的研究。而普通的細(xì)胞培養(yǎng)方式使細(xì)胞間缺少細(xì)胞外基質(zhì),中斷細(xì)胞間的各種連接限制細(xì)胞的分化發(fā)育,致使細(xì)胞并不能真實(shí)的反應(yīng)體內(nèi)的真實(shí)功能特征,也不具有類似機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的立體結(jié)構(gòu),更不像機(jī)體器官那樣包含有多種類型的細(xì)胞,這就嚴(yán)重限制了對于這些致病性病原體的致病機(jī)制的研究。此外,很多病毒在普通的這種細(xì)胞培養(yǎng)體系中不能或難以生長和培養(yǎng)。ALI培養(yǎng)能夠模擬細(xì)胞在人體內(nèi)的生長狀態(tài),形成具有類似組織結(jié)構(gòu)和生理功能的假復(fù)層柱狀上皮,是在模擬人體結(jié)構(gòu)方面細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一次飛躍,克服了上述三種培養(yǎng)體系分離病毒的缺陷。這一技術(shù)對研究和探討上皮細(xì)胞的多種生理功能及在病毒致病機(jī)制方面具有最要意義。但該種分離和培養(yǎng)病毒體系的技術(shù)要求較高,其研究和推廣還處在不斷完善和發(fā)展的過程。近三十年來,全球新發(fā)和再發(fā)傳染病不斷涌現(xiàn),對人類健康造成巨大威脅。其中一半以上是由病毒引起,如流感病毒(influenza virus)、人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)、C組鼻病毒(Human rhinovirus C,HRV-C)、人冠狀病毒(Human coronavirus)和人偏肺病毒(human Metaenumovirus,hMPV)等,而部分新發(fā)病毒(HBoV、HRV-C,HKU1等)的體外培養(yǎng)分離非常困難,從而限制了對其機(jī)制的研究。為了實(shí)現(xiàn)HBoV等難培養(yǎng)病毒的體外培養(yǎng)增殖,為呼吸道相關(guān)病毒的體外致病機(jī)制的研究提供一種更有效的細(xì)胞體系,本研究建立了一套完整的呼吸道原代上皮細(xì)胞的氣液界面培養(yǎng)體系,通過搭建體外上皮細(xì)胞ALI培養(yǎng)的技術(shù)平臺(tái),在體外培養(yǎng)環(huán)境下最大程度模擬和再現(xiàn)上皮細(xì)胞的體外分化,成功培養(yǎng)出假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞,形成了標(biāo)準(zhǔn)化的上皮細(xì)胞ALI培養(yǎng)技術(shù)方案,并實(shí)現(xiàn)了人博卡病毒等難培養(yǎng)病毒的體外培養(yǎng)增殖,為新發(fā)、現(xiàn)存及潛在難培養(yǎng)病毒的體外分離提供了技術(shù)支撐和研究平臺(tái)。本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：1、摸索建立了一套完整的原代呼吸道上皮細(xì)胞ALI培養(yǎng)方案,體外成功培養(yǎng)獲得具有類似組織結(jié)構(gòu)和生理功能的假復(fù)層呼吸道柱狀上皮細(xì)胞。主要包括：(1)建立了適用于ALI培養(yǎng)的原代呼吸道上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方案。體外成功分離和培養(yǎng)(傳代)小鼠、豬和人的呼吸道上皮原代細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光染色鑒定證實(shí)。(2)建立了原代呼吸道上皮細(xì)胞ALI培養(yǎng)方案。通過比較不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果,并進(jìn)行了多個(gè)指標(biāo)的鑒定后證實(shí)本實(shí)驗(yàn)ALI培養(yǎng)后的呼吸道上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué),MUC5AC蛋白,IV型p-微管蛋白(β-tubulinIV),閉合小環(huán)蛋白-1(Zona occludens-1)的表達(dá)及緊密連接和假復(fù)層的形成情況都與氣管組織結(jié)構(gòu)類似。2、應(yīng)用ALI培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì)胞成功實(shí)現(xiàn)了多種呼吸道病毒的培養(yǎng)和增殖,為深入開展致病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。主要包括：(1)多種病毒實(shí)現(xiàn)增殖。在ALI培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì)胞接種陽性病毒標(biāo)本后,包括流感病毒、腺病毒、hMPV和HBoV,熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示所有病毒均有良好的增殖效果。(2)細(xì)胞接種病毒后出現(xiàn)了明顯的免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子和趨化因子的測定和分析結(jié)果顯示,ALI培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì)胞接種博卡病毒后多種細(xì)胞因子和趨化因子都有升高,包括IL-6、IL-8、IP-10、TNF-α和CCL5。在感染120h時(shí)和對照組比較IL-6、IP-10和CCL5的升高最為明顯。IL-1β和MIP-1b未反映出變化。綜上所述,我們成功建立了三種動(dòng)物類型(小鼠、豬和人類)的呼吸道上皮細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)及ALI培養(yǎng)方案,并利用培養(yǎng)分化的假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了多種呼吸道病毒的體外培養(yǎng),為難培養(yǎng)呼吸道病毒的體外細(xì)胞培養(yǎng)提供了技術(shù)平臺(tái),為深入開展呼吸道病毒致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道上皮細(xì)胞 原代細(xì)胞培養(yǎng) 氣液界面 細(xì)胞因子 趨化因子
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R56
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-21
• 實(shí)驗(yàn)材料和方法21-37
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-60
• 討論60-67
• 總結(jié)67-68
• 創(chuàng)新點(diǎn)68-69
• 文獻(xiàn)綜述69-85
• 參考文獻(xiàn)85-96
• 縮略詞對照表96-98
• 個(gè)人簡歷98-99
• 致謝99

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