本文關(guān)鍵詞：粘著斑激酶通過(guò)整合素β1對(duì)肺成纖維細(xì)胞遷移的影響機(jī)制

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【摘要】：目的:研究粘著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)通過(guò)整合素β1對(duì)肺成纖維細(xì)胞遷移影響的效果和機(jī)制。方法:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.1人肺成纖維細(xì)胞(Human Lung Fibroblasts,HLFs)從美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)購(gòu)買。細(xì)胞在含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、2mM/L谷氨酰胺、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素、100單位/ml慶大霉素的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)保存和傳代。培養(yǎng)至第7-9代用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞重懸于DMEM中,接種到纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)包被的培養(yǎng)板中,按各組的實(shí)驗(yàn)要求干預(yù)、培養(yǎng)、裂解細(xì)胞,收集全細(xì)胞裂解液備用,或者行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。1.2免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot,WB)檢測(cè)FAK的激活率,Western blot結(jié)合免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)整合素β1是否與FAK結(jié)合,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定HLFs在FN上的遷移功能。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2.1 8-11周齡C57BL/6小鼠分4組:正常對(duì)照組,PF-573228對(duì)照組,博萊霉素(Bleo)組,PF-573228干預(yù)組。小鼠被麻醉后,以Bleo(3 U/公斤體重,只小鼠的劑量用生理鹽水配至50μl)或生理鹽水(50μl/只)緩慢經(jīng)氣管注射。隨后正常對(duì)照組和Bleo組每日經(jīng)腹腔注射0.2ml生理鹽水,PF-573228對(duì)照組和PF-573228干預(yù)組每日經(jīng)腹腔注射PF-573228(50mg/kg,每只小鼠的劑量用生理鹽水配至0.2ml)。21天后獲取小鼠肺組織,肺組織用于病理學(xué)、蛋白組學(xué)檢查及檢測(cè)全肺羥脯氨酸。2.2肺病理組織標(biāo)本HE(Hematoxylin-Eosin,HE)染色用于阿什克羅夫特(Ashcroft)評(píng)分,全肺組織檢測(cè)羥脯氨酸含量,Western blot檢測(cè)FN、Ⅰ型前膠原蛋白(Procollagen TppeⅠProtein,Pro-Col1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)評(píng)價(jià)肺纖維化的程度;westernblot檢測(cè)rac、fak的激活率和s100a4表達(dá),評(píng)價(jià)肺組織中肺成纖維細(xì)胞的遷移程度。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析(用于兩組間的比較)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)三至四次,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M包含5到6只動(dòng)物,重復(fù)兩次,p0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowthfactor-bb,pdgf-bb)誘導(dǎo)hlfs過(guò)程中調(diào)節(jié)fak激活及調(diào)節(jié)fak與整合素β1結(jié)合的機(jī)制pdgf-bb誘導(dǎo)fak激活呈雙峰樣改變,第一個(gè)是較低的峰值pdgf-bb的濃度在0.1-0.5ng/ml的范圍,第二個(gè)是最高峰值pdgf-bb的濃度在1-5ng/ml的范圍。給予2ng/mlpdgf-bb誘導(dǎo)hlfs時(shí),fak激活最早發(fā)生在誘導(dǎo)后的6分鐘。fak早期有一定幅度的激活發(fā)生在pdgf-bb誘導(dǎo)后的30分鐘。隨后fak激活有下降趨勢(shì),但于pdgf-bb誘導(dǎo)后5小時(shí)fak激活再逐步增加,并于pdgf-bb誘導(dǎo)后20小時(shí)達(dá)到頂峰。pdgf-bb以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)hlfs遷移。在hlfs培養(yǎng)過(guò)程中,如果沒(méi)有pdgf-bb的誘導(dǎo)fak與整合素β1無(wú)關(guān)聯(lián)(圖2-7)。在pdgf-bb誘導(dǎo)下,fak與整合素β1直接結(jié)合,這種結(jié)合在pdgf-bb誘導(dǎo)10個(gè)小時(shí)達(dá)到高峰。2.fak抑制劑對(duì)pdgf-bb誘導(dǎo)hlfs遷移,及對(duì)fak與整合素β1結(jié)合的影pdgf-bb誘導(dǎo)遷移率(每24小時(shí)傷口覆蓋區(qū)域)與其被使用的劑量呈正相關(guān),誘導(dǎo)遷移率最高的pdgf-bb范圍為1-5ng/ml。pdgf-bb誘導(dǎo)hlfs遷移也是時(shí)間依賴的方式。pdgf誘導(dǎo)5個(gè)小時(shí)和24小時(shí)后遷移率分別顯著增加(p0.01)。pf-573228抑制pdgf-bb誘導(dǎo)fak激活(py397offak)和抑制pdgf-bb誘導(dǎo)的hlfs遷移的劑量依賴性的方式。給予fak抑制劑并沒(méi)有阻止fak與整合素β1結(jié)合,pf-573228即使在能有效地抑制pdgf-bb誘導(dǎo)fak激活和hlfs遷移的劑量(1或5μm)下仍沒(méi)有影響fak-整合素β1結(jié)。3.整合素β1在fak激活和fak調(diào)控hlfs遷移中的功能與對(duì)照免疫球蛋白組相比,整合素β1抑制性抗體減少約85%的遷移(p0.001)。整合素α5或α4抑制性抗體抑制約50%的hlfs在fn上遷移。阻斷整合素αvβ3、αvβ6或αvβ8,各抑制HLFs在FN上約5%的遷移。整合素β1抑制性抗體明顯阻斷PDGF-BB-誘導(dǎo)的FAK的激活。當(dāng)HLFs接種到FN上沒(méi)有PDGF-BB誘導(dǎo)時(shí),整合素β1抑制性抗體或?qū)φ彰庖咔虻鞍譍組沒(méi)有影響FAK基本的激活。整合素β1阻斷抗體中斷了PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs中FAK與整合素β1聯(lián)系。4.FAK抑制劑PF-573228對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)效果及機(jī)制研究肺組織的形態(tài)學(xué)分析揭示FAK抑制劑干預(yù)組與Bleo組相比Ashcroft肺纖維化評(píng)分大約下降1.2分(p0.01)。檢測(cè)羥脯氨酸替代總膠原蛋白在整個(gè)肺組織含量,FAK抑制劑干預(yù)組較Bleo組總膠原蛋白水平顯著降低(p0.01)。FAK抑制劑干預(yù)組與Bleo組相比,FAK抑制劑顯著抑制FAK和Rac激活,和顯著降低S100A4表達(dá),顯著降低整個(gè)肺FN和Pro-Col1含量,顯著降低肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。結(jié)論:1.PDGF-BB以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式激活FAK,并且使FAK被招募后直接與整合素β1結(jié)合。2.FAK抑制劑PF-573228以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式抑制PDGF-BB誘導(dǎo)FAK的激活,并可能通過(guò)此機(jī)制抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HLFs遷移。FAK與整合素β1相結(jié)合可能為FAK激活的上游信號(hào)。3.整合素β1在PDGF-BB誘導(dǎo)人肺HLFs遷移過(guò)程中發(fā)揮主要作用,整合素β1粘附在FN上對(duì)FAK和整合素β1結(jié)合,以及對(duì)隨后PDGF-BB誘導(dǎo)FAK的激活都是必不可少的。4.FAK抑制劑通過(guò)抑制HLFs的遷移、抑制細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)蛋白質(zhì)產(chǎn)生、抑制肌HLFs的分化,從而抑制肺纖維化病變的發(fā)展。5.FAK信號(hào)通路是治療特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)潛在的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：粘著斑激酶 整合素β1 纖維化 遷移 細(xì)胞生物學(xué)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-15
• 第一部分 PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs過(guò)程中調(diào)節(jié)FAK激活及調(diào)節(jié)FAK與整合素 β1 結(jié)合的機(jī)制研究15-28
• 1 材料15-17
• 2 方法與步驟17-23
• 3 結(jié)果23-25
• 4 討論25-28
• 第二部分 FAK抑制劑對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs遷移功能的影響28-36
• 1 材料28
• 2 方法與步驟28-32
• 3 結(jié)果32-35
• 4 討論35-36
• 第三部分 不同整合素在PDGF-BB誘導(dǎo)HLFs遷移過(guò)程中的功能差異及整合素 β1抗體對(duì)FAK功能的影響36-43
• 1 材料36
• 2 方法與步驟36-39
• 3 結(jié)果39-41
• 4 討論41-43
• 第四部分 FAK抑制劑PF-573228對(duì)Bleo誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)效果及機(jī)制研究43-55
• 1 材料43-44
• 2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟44-49
• 3 結(jié)果49-53
• 4 討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 綜述60-74
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、論著及承擔(dān)的課題74-76
• 縮略語(yǔ)表76-77
• 致謝77-79

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鄭金旭;管淑紅;許清;湯艷;劉繼柱;呂曉婷;;Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Napsin A基因?qū)Ψ卫w維化的干預(yù)作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2010年46期

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本文編號(hào)：741491