本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用等位基因差異表達(dá)探索肺部疾病的遺傳機(jī)制

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【摘要】：慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌是兩種常見的肺部疾病。COPD特征為持續(xù)存在的氣流受限,目前排全世界死亡原因的第三位。肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率快速增長,是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病。多項(xiàng)研究表明,在C OPD和肺癌的發(fā)生中,遺傳因素起著重要的作用。因此,研究COPD.肺癌疾病發(fā)生相關(guān)的基因與致病位點(diǎn)的致病機(jī)制,對于這兩種疾病的預(yù)防和治療有著重要意義。為尋找與這兩種肺部疾病相關(guān)的變異,科學(xué)界開展了多項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS),大大深化了人類對于其發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí),但也存在一些問題仍待解決。首先,GWAS發(fā)現(xiàn)的只是遺傳標(biāo)記,而非真實(shí)的致病位點(diǎn)。其次,GWAS無法解釋這些突變的致病機(jī)理。等位基因差異表達(dá)(allele-specific expression,ASE)作為一種特殊的遺傳學(xué)現(xiàn)象,成為一種篩選功能性突變的新手段。這種方法,由于(1)可以消除組織生理狀態(tài)等因素的影響,極為準(zhǔn)確和靈敏；(2)對樣本數(shù)量要求不高；(3)檢測手段簡單可靠、成本低、耗時(shí)短;(4)受調(diào)控目標(biāo)基因明確；(5)可大大縮小搜索功能性位點(diǎn)的范圍,提高研究效率,因此被多位研究人員使用,進(jìn)行功能性突變的確定和機(jī)理研究。完成的內(nèi)容以及結(jié)論：本研究收集前期肺部疾病GWAS研究的陽性結(jié)果,從中挑選45個(gè)編碼區(qū)突變,使用SNaPshot對其ASE進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)8個(gè)位點(diǎn)存在ASE現(xiàn)象,其中最顯著的分別是與COPD疾病相關(guān)的P2RX7基因位點(diǎn)rs3751143、PSORS1C1基因位點(diǎn)rs1265093以及與肺癌相關(guān)的CHRNA3 基因位點(diǎn)rs1051730這三個(gè)位點(diǎn),表明與其連鎖的突變可調(diào)控這些基因表達(dá)。通過質(zhì)粒載體構(gòu)建、突變生成、雙熒光素酶報(bào)告基因等功能基因組學(xué)手段確定了19個(gè)功能突變。然后通過染色質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)構(gòu)象捕獲確定了rs11615997與rs115664826位點(diǎn)通過改變POU2F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分別調(diào)控P2RX7和PSORS1C1基因的表達(dá),影響COPD的易感性。研究的意義：本研究有助于闡明這些肺部疾病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,為系統(tǒng)地了解疾病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。同時(shí),通過小分子化合物阻斷關(guān)鍵蛋白質(zhì)作用,是癌癥化療的主要手段。因此,對于相關(guān)致病基因的確定,可為癌癥藥物設(shè)計(jì)和治療提供新的靶標(biāo)。其次,本研究可為綜合應(yīng)用ASE和功能基因組學(xué)手段,研究其他疾病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控、鑒別人類基因組功能性區(qū)域提供一個(gè)良好的范例。此外,考慮到基因的多效性,本研究對于所涉及基因相關(guān)的其他疾病,可能亦有非常重要的參考價(jià)值。論文解決的主要問題：COPD與肺癌的遺傳機(jī)制。論文的創(chuàng)新點(diǎn)：常見的基于GWAS的功能基因組學(xué)研究,多基于大樣本的精細(xì)定位進(jìn)行。本研究基于少量樣本的ASE開展,以快速確定可調(diào)控基因表達(dá)的致病突變的存在,避免了統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可能產(chǎn)生的假陽性,進(jìn)而開展詳盡功能基因組學(xué)分析,大大節(jié)約了時(shí)間以及相關(guān)人力物力,是本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新之處。
【關(guān)鍵詞】：GWAS 肺癌 COPD ASE
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563.9;R734.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 研究背景簡介10-17
• 1 慢性阻塞性肺疾病COPD10-12
• 1.1. COPD簡介10
• 1.2. COPD病因10-11
• 1.3. COPD并發(fā)癥及治療現(xiàn)狀11-12
• 1.4. COPD與GWAS12
• 2 肺癌12-15
• 2.1 肺癌簡介12-13
• 2.2 肺癌病因與治療現(xiàn)狀13-14
• 2.3 肺癌與GWAS14-15
• 3 GWAS和基于GWAS的功能研究及缺點(diǎn)15-16
• 4 等位基因差異表達(dá)(allele-specific expression,ASE)簡介16
• 5 研究目的和意義16-17
• 第二章 材料與方法17-78
• 1 材料17-19
• 1.1 細(xì)胞系、質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞17
• 1.1.1 細(xì)胞系17
• 1.1.2 質(zhì)粒17
• 1.1.3 受體細(xì)胞17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑17-19
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)主要使用的生化分子試劑17-18
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒18
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)所用的酶18-19
• 1.3 主要使用軟件19
• 1.4 樣品來源19
• 2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備19-20
• 3 實(shí)驗(yàn)方法20-78
• 3.1 GWAS結(jié)果收集20
• 3.2 DNA、RNA提取(人正常血液和肺部組織)20-23
• 3.2.1 酚氯仿抽提法-提取人正常血液和肺部組織DNA20-22
• 3.2.2 提取人正常肺部組織總RNA22-23
• 3.3 肺部組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA23-24
• 3.4 等位基因差異表達(dá)ASE24-35
• 3.4.1 引物最適溫度(PCR gradient)24-25
• 3.4.2 基因分型與ASE分析25-35
• 3.5 分子克隆35-42
• 3.5.1 候選基因P2RX7、CHRNA3、PSORS1C135
• 3.5.2 制備感受態(tài)細(xì)胞35-36
• 3.5.3 酶切及測序引物36-42
• 3.5.4 獲取帶有酶切位點(diǎn)的目的片段42
• 3.6 載體構(gòu)建42-46
• 3.7 定點(diǎn)突變生成46-53
• 3.8 轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞與功能位點(diǎn)篩選53-57
• 3.8.1 BEAS-2B細(xì)胞復(fù)蘇傳代與凍存53-55
• 3.8.2 BEAS-2B細(xì)胞轉(zhuǎn)染55-56
• 3.8.3 表達(dá)量檢測56-57
• 3.9 功能基因組學(xué)分析57-78
• 3.9.1 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)57-64
• 3.9.2 染色質(zhì)構(gòu)象捕獲3C64-78
• 3.9.2.1 BAC提取65-67
• 3.9.2.2 BAC酶切酶連67-70
• 3.9.2.3 BEAS-2B細(xì)胞酶切酶連70-73
• 3.9.2.4 3C產(chǎn)物RT-qPCR73-78
• 第三章 結(jié)果78-89
• 1 GWAS結(jié)果收集78
• 2 等位基因差異表達(dá)結(jié)果78-80
• 3 分子克隆、構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)染雙熒光素酶表達(dá)結(jié)果80-85
• 3.1 P2RX7雙熒光報(bào)告基因結(jié)果80-81
• 3.2 PSORS1C1雙熒光報(bào)告基因結(jié)果81-82
• 3.3 CHRNA3雙熒光報(bào)告基因結(jié)果82-85
• 4 染色質(zhì)構(gòu)象捕獲3C結(jié)果85-87
• 5 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果87-89
• 第四章 討論與展望89-90
• 附錄90-92
• 1 附錄1 論文中使用的縮寫及英文對照90-91
• 2 附錄2 常用數(shù)據(jù)庫與網(wǎng)上生物學(xué)資源91-92
• 參考文獻(xiàn)92-97
• 碩士在讀期間參與基金項(xiàng)目、發(fā)表論文、榮譽(yù)與獎(jiǎng)勵(lì)97-98
• 1 參與的基金項(xiàng)目97
• 2 發(fā)表和投稿的論文97
• 3 榮譽(yù)與獎(jiǎng)勵(lì)97-98
• 致謝98

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