本文關(guān)鍵詞：Rab5介導(dǎo)的β-AR囊泡運(yùn)輸調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制

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【摘要】：急性呼吸窘迫綜合癥早期特征是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMECs)損傷后通透性增高，肺泡與肺間質(zhì)內(nèi)積聚大量的水腫液，肺微血管內(nèi)皮完整性是治療和預(yù)防發(fā)生ARDS的重要環(huán)節(jié)。Beta-腎上腺素受體(Beta-adrenergic receptorβ-AR)在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。β-ARs具有三種亞型，β1-AR和β2-AR主要在心臟、肺臟等重要臟器血管系統(tǒng)發(fā)揮一定的作用，而β3-AR主要與脂肪組織相關(guān)。受體信號(hào)通路的激活與受體的內(nèi)吞、脫敏、循環(huán)和降解等密切相關(guān)，任何影響這些過(guò)程的因子都可能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們既往研究表明Rab1可調(diào)節(jié)β-AR在細(xì)胞膜上的表達(dá)，從而調(diào)控LPS損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程的機(jī)制，為臨床藥物干預(yù)提供了新的靶點(diǎn)和策略。 Rab5作為Ras超家族的一個(gè)成員，主要有Rab5a、Rab5b和Rab5c三種亞型，研究最多的是Rab5a。在HEK293、cos-1等細(xì)胞，，Rab5主要調(diào)控細(xì)胞囊泡從細(xì)胞膜向早期內(nèi)涵體的錨定和融合，同時(shí)其介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程可能參與激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體下調(diào)。但是，在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，Rab5介導(dǎo)β-ARs的內(nèi)吞和下調(diào)的機(jī)制以及對(duì)屏障功能和通透性的調(diào)控作用尚未研究。 本實(shí)驗(yàn)利用LPS處理大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，模擬急性呼吸窘迫綜合癥的細(xì)胞病理，轉(zhuǎn)染野生型和負(fù)性突變體的Rab5a以及小干擾RNA，研究了Rab5a調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞β-AR胞內(nèi)運(yùn)輸、膜上的表達(dá)、內(nèi)吞和下調(diào)等過(guò)程的機(jī)制，同時(shí)，研究了β-AR信號(hào)通路的激活與內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和粘附連接的調(diào)控關(guān)系，以及Rab5a如何參與調(diào)控β-AR信號(hào)通路調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能及滲透性。 研究方法： 1.采用原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)大鼠PMECs，并對(duì)其進(jìn)行綜合鑒定：CD34、BSI、Ⅷ因子，同時(shí)觀察各代細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和亞結(jié)構(gòu)。 2.實(shí)時(shí)細(xì)胞監(jiān)測(cè)儀iCELLigence系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞屏障功能進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。 3.運(yùn)用WesternBlot檢測(cè)LPS處理RPMECs后occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜和漿內(nèi)表達(dá)情況。 4.應(yīng)用熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染Rab5a WT、Rab5a S34N、Rab5a siRNA后β2腎上腺素受體在細(xì)胞內(nèi)的亞定位。 5.應(yīng)用內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)和下調(diào)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Rab5aWT、Rab5asiRNA后β2腎上腺素受體的內(nèi)吞和下調(diào)變化。 6.運(yùn)用ELISA法檢測(cè)RPMECs經(jīng)LPS處理以及轉(zhuǎn)染Rab5asiRNA后監(jiān)測(cè)細(xì)胞指數(shù)改變。 研究結(jié)果： 1.綜合鑒定結(jié)果顯示：CD34，Ⅷ因子和BSI結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性，電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜，細(xì)胞核，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體及溶酶體等亞結(jié)構(gòu)。 2.LPS處理RPMECs后細(xì)胞指數(shù)呈時(shí)間和濃度依賴形式降低，屏障功能在6-8h之間破壞最明顯。同時(shí)，occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜上的表達(dá)顯著降低。β2腎上腺素受體激活能減弱細(xì)胞指數(shù)的降低程度，同時(shí)也能抑制兩種連接蛋白的減低。 3.正常情況下，β2-AR主要聚集在胞膜，加入激動(dòng)劑ISO后，主要聚集在胞漿；轉(zhuǎn)染Rab5aWT后，β2-AR主要聚集在胞膜，加入激動(dòng)劑ISO后，主要聚集在胞漿；轉(zhuǎn)染Rab5asiRNA后，β2-AR主要聚集在胞膜，加入激動(dòng)劑ISO后，仍然聚集在胞膜。 4.轉(zhuǎn)染Rab5aS34N和Rab5asiRNA后，膜表面β-AR分別增加23.9%和28.3%，β2-AR分別增加32.1%和35.6%，轉(zhuǎn)染Rab5aWT無(wú)明顯改變。LPS處理RPMECs后β2-AR降低42%，可被Rab5aS34N和Rab5asiRNA分別提高39%和37%。 5.[3H]-CGP12177誘導(dǎo)的受體內(nèi)吞在30min時(shí)達(dá)到最高，Rab5asiRNA顯著抑制內(nèi)吞速率；Rab5aWT無(wú)明顯作用。ISO誘導(dǎo)的受體下調(diào)在16h達(dá)到最低，Rab5asiRNA顯著抑制受體下調(diào)；Rab5a無(wú)明顯作用。 6.Rab5a基因下調(diào)后對(duì)內(nèi)皮屏障功能無(wú)明顯改變，但轉(zhuǎn)染后加入激動(dòng)劑ISO或ISO/Atenolol后，LPS對(duì)內(nèi)皮屏障功能的破壞作用較正常組明顯減弱。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)BSA的通透性也有相似的改變。 結(jié)論： 1.β2-AR信號(hào)通路對(duì)LPS導(dǎo)致的RPMECs屏障功能的破壞有一定的保護(hù)作用。 2.Rab5a可調(diào)節(jié)β2-AR的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和膜上的表達(dá)。 3.Rab5a通過(guò)調(diào)節(jié)β2-AR調(diào)控RPMECs的屏障功能和對(duì)大分子的滲透性。
【關(guān)鍵詞】：肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 脂多糖 急性呼吸窘迫綜合征 屏障功能 滲透性 β腎上腺素受體 Rab5a蛋白 Rab5aWT Rab5aS34N siRNA
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563.8
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-6
• Abstract6-10
• 摘要10-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 β2-AR信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (PMECs) 的屏障功能14-31
• 2.1 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定14-20
• 2.1.1 材料與方法14-17
• 2.1.2 結(jié)果17-20
• 2.1.3 討論20
• 2.1.4 小結(jié)20
• 2.2 β2-A R 信號(hào)通路調(diào)控大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞( PMEC s)的屏障功能20-31
• 2.2.1 材料與方法20-25
• 2.2.2 結(jié)果25-27
• 2.2.3 討論27-29
• 2.2.4 小結(jié)29-31
• 第三章 Rab5a對(duì)β-AR在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表達(dá)及胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊?/span>31-45
• 3.1 Rab5a對(duì)β-AR在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表達(dá)的影響31-40
• 3.1.1 材料和方法31-35
• 3.1.2 結(jié)果35-39
• 3.1.3 討論39-40
• 3.1.4 小結(jié)40
• 3.2 Rab5a對(duì)β-AR在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞和下調(diào)的影響40-45
• 3.2.1 材料和方法40-42
• 3.2.2 結(jié)果42-43
• 3.2.3 討論43-44
• 3.2.4 小結(jié)44-45
• 第四章 Rab5a對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能及滲透性的影響45-51
• 4.1 材料和方法45-46
• 4.2 結(jié)果46-49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 小結(jié)50-51
• 全文結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 文獻(xiàn)綜述 Rab5蛋白的研究進(jìn)展56-67
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 在讀期間發(fā)表論文67-68
• 致謝68

本文編號(hào)：701298