本文關鍵詞：香煙提取物對人肺泡Ⅱ型上皮細胞MMP-9、TIMP-1分泌的影響及意義

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【摘要】：目的：研究表明，香煙煙霧中的有害毒性物質多達上千種，是多種肺部疾病的共同危險因素。也有研究提出，吸煙可能與特發(fā)性肺纖維化(IPF)的發(fā)病有著密切的關聯(lián)，但其具體作用機制尚不完全清楚。香煙煙霧中含有多種炎癥介質，包括氧化劑(coxidant)和朊酶類(proteases)等，最終可導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡參與眾多肺部疾病的發(fā)病。近年，在肺間質纖維化的形成機制中，MMPs/TIMPs（金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑）比例失衡逐漸成為研究的熱點和重點。其中，MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）作為一種重要的基質金屬蛋白酶，在細胞外基質降解、肺組織結構重塑等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，參與多種肺部疾病的發(fā)生，其活性受特異性抑制劑，即基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的調(diào)節(jié)。在各種外界刺激因素的作用下，二者比例及相互作用發(fā)生紊亂，可導致細胞外基質降解受阻、細胞外蛋白沉積、肺組織重構等病理改變，從而參與肺間質纖維化(pulmonary interstitial fiberosis)的發(fā)病。 本實驗旨在通過研究香煙提取物(cigerette smoking extract，CSE)對體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的人A549細胞分泌基質金屬蛋白酶9(matrixMetalloproteinase-9，MMP-9)及其組織抑制因子(tissue inhibitorofmetal loproteinase-l，TIMP-1)的影響，探討吸煙作為一種危險因素參與肺間質纖維化過程的可能機制。 方法：體外培養(yǎng)人A549細胞，取指數(shù)生長期細胞用于實驗。兩支去過濾嘴香煙由經(jīng)改造的50ml注射器負壓吸引裝置連續(xù)勻速抽吸燃燒著，將煙霧經(jīng)另一出口入20ml1640培養(yǎng)基中制成懸液。15分鐘內(nèi)將2支香煙燃盡。充分搖動使其溶解，用氫氧化鈉（NAOH）將pH調(diào)至7.4左右，0.22um孔徑的濾器過濾，除去細菌和雜質，所得溶液在30分鐘內(nèi)用于實驗。將原液配成不同濃度干預人A549細胞24小時，并依據(jù)濃度的不同將實驗分為四組：對照組、 A組（2.5％CSE干預組）、B（5％CSE干預組）、C（10％CSE干預組）。并分別收集C組干預A549細胞0h，3h，6h，9h，12h，48h的培養(yǎng)上清液。光學倒置電子顯微鏡分別觀察四組細胞干預24小時后的形態(tài)學變化；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測上清液中MMP-9、TIMP-1的濃度；分別收集干預24h后各組培養(yǎng)細胞，提取細胞中的蛋白質， BCA法測定蛋白濃度，Western Blot法檢測細胞中MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。 結果： 1、細胞形態(tài)學變化 倒置顯微鏡觀察各組培養(yǎng)24小時后的細胞形態(tài)。對照組細胞表現(xiàn)為貼壁、扁平梭形生長，細胞形態(tài)規(guī)則，細胞生長旺盛。在經(jīng)過不同CSE濃度干預后的A（2.5％CSE干預組）、B（5％CSE干預組）、C（10％CSE干預組）三組細胞形態(tài)較對照組差異較大，且呈現(xiàn)出干預濃度越高，細胞生長情況越差的特點。主要表現(xiàn)為細胞數(shù)量減少、體積縮小，細胞貼壁能力下降，細胞之間空間增大。而C組細胞形態(tài)變化較對照組更為顯著。大部分細胞已回縮變圓且細胞密度明顯減低，胞內(nèi)顆粒狀物質明顯增多，細胞貼壁能力大大減低。 2、CSE干預后A549細胞分泌MMP-9的變化 ELISA結果顯示，對照組MMP-9含量為（1.70±0.12ng/ml），A、B、C三組濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，三組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)，且A、B、C三組之間相互比較差異也具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。同時，觀察C組作用不同時間MMP-9的表達我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間的延長，其表達呈不斷升高趨勢。0h時其濃度為（1.76±0.31ng/ml），48h時其濃度最高達到（9.29±0.76ng/ml）。經(jīng)過統(tǒng)計學分析可以得出結論，3h-48h各組與0h比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)，9h-48h與3h比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、CSE干預后A549細胞分泌TIMP-1的變化 ELISA結果顯示，對照組TIMP-1含量為（2.20±0.31ng/ml），A、B、C三組濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，三組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)，且A、B、C三組之間相互比較也具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。同時，觀察C組作用不同時間TIMP-1的表達我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間的延長，其表達呈不斷升高趨勢。0h時其濃度為（2.52±0.41ng/ml），48h時其濃度最高達到（16.31±0.96ng/ml）。經(jīng)過統(tǒng)計學分析可以得出結論，3h-48h各組與0h比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)，9h-48h與3h比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4、CSE干預后A549細胞MMP-9/TIMP-1的變化 ELISA結果顯示在A549細胞培養(yǎng)24小時后，對照組MMP-9/TIMP-1數(shù)值為（0.77±0.05），而在經(jīng)CSE干預后的A、B、C三組數(shù)值相比對照組均降低，三組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)，，但各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。觀察C組在干預的不同時間MMP-9/TIMP-1比值的變化發(fā)現(xiàn)，12h、24h及48h與0h比較具有統(tǒng)計學意義(P0.05)，而3h、6h及9h與0h比較無明顯統(tǒng)計學意義。0h、6h與3h比較差異無明顯統(tǒng)計學意義，而9h、12h、24h、48h與3h比較差異則具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5、 CSE干預A549細胞24h后MMP-9、TIMP-1蛋白的表達 各組細胞干預24小時后Western Blot顯示，對照組MMP-9及TIMP-1蛋白表達較少，而A、B、C各組兩種蛋白表達均較對照組升高，且隨著干預濃度的升高蛋白表達逐漸增加。 結論： 1、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌MMP-9、TIMP-1增加。 2、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌MMP-9、TIMP-1增加，且呈現(xiàn)出時間及濃度依賴性。 3、CSE能引起MMP-9/TIMP-1比例失衡，并呈現(xiàn)出先高后低的趨勢。 4、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細胞產(chǎn)生MMP-9/TIMP-1比例失衡，其作為危險因素可能通過這一機制參與吸煙相關性肺間質纖維化的形成過程。
【關鍵詞】：香煙提取物(CSE) 人A549細胞 基質金屬蛋白酶-9(MMP-9) 基質金屬蛋白酶組織抑制因子-l(TIMP-1) 肺間質纖維化（pulmonary interstitial fiberosis）
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-19
• 結果19-21
• 附圖21-27
• 附表27-28
• 討論28-31
• 結論31
• 參考文獻31-34
• 綜述 基質金屬蛋白酶及細胞因子之間的關系與肺間質纖維化34-44
• 參考文獻40-44
• 致謝44-45
• 個人簡歷45

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 戴莉莉,秦斌斌,陳曉紅,祝捚;慢性阻塞性肺疾病合并肺間質纖維化的臨床研究[J];上海第二醫(yī)科大學學報;2004年09期

2 譚善忠;劉成海;張煒;陸雄;葉偉成;蔡貞貞;劉平;;MMP-2/9活性與TIMP-1/2蛋白表達在大鼠肺纖維化形成中的變化特點[J];中西醫(yī)結合學報;2006年04期

3 韓照升,徐軍,鐘南山;人支氣管上皮細胞表達基質金屬蛋白酶9的實驗研究[J];中華結核和呼吸雜志;2000年12期

4 謝麗華;陳平;陳芳;向旭東;周銳;吳尚潔;;香煙提取物對人內(nèi)皮細胞基質金屬蛋白酶9和組織金屬蛋白酶抑制劑1分泌的影響[J];中華結核和呼吸雜志;2006年10期

本文編號：697761