本文關(guān)鍵詞：缺第4和5外顯子的IL-7剪接變異體蛋白表達(dá)及活性研究

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【摘要】：研究背景:機(jī)體多種細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-7,其主要生物作用是參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié);IL-7有多個剪接變異體,其生物活性的研究才剛剛開始。研究報道IL-7具有強(qiáng)大的抗纖維化作用,其作用機(jī)制主要為通過激活JAK1/STAT1信號通路上調(diào)Smad7表達(dá)及下調(diào)TGF-β1的表達(dá)以阻斷TGF-β誘導(dǎo)膠原合成。IL-7δ4/5是IL-7缺第4和第5外顯子的剪接變異體,其生物學(xué)作用的研究才剛展開,其是否也影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展亦有待研究。研究目的:本課題利用原核表達(dá)載體pET-21b表達(dá)IL-7δ4/5蛋白,包涵體經(jīng)溶解、復(fù)性、純化后,獲得復(fù)性的高純度的蛋白質(zhì),經(jīng)Western-blot鑒定后,采用TGF-β1和IL-7作為對照分析其對肺成纖維細(xì)胞MRC-5的影響,并初步探討其作用機(jī)制。研究方法:1.IL-7δ4/5蛋白的制備:以18-T-IL-7δ4/5(實(shí)驗(yàn)室保存)作為模板進(jìn)行亞克隆,在成功構(gòu)建IL-7δ4/5原核表達(dá)質(zhì)粒pET-21b-IL-7δ4/5后,進(jìn)行誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白質(zhì)可溶性分析,進(jìn)一步優(yōu)化其誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間,以確定最佳參數(shù)。IL-7δ4/5蛋白包涵體經(jīng)溶解后,蛋白的復(fù)性用梯度透析法,純化用親和層析色譜法。純化后,以鼠抗人IL-7抗體和6×His單克隆抗體為一抗,分別對IL-7δ4/5蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。2.IL-7δ4/5蛋白對人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的影響:分別用IL-7、IL-7δ4/5和TGF-β1作用于MRC-5細(xì)胞,細(xì)胞增殖用MTT法檢測,collagenI、α-SMA蛋白表達(dá)用Western-blot法檢測。結(jié)果:1.IL-7δ4/5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、復(fù)性及純化:重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-21b-IL-7δ4/5構(gòu)建成功。進(jìn)行PCR檢測,擴(kuò)增的目的片段約為345bp,和預(yù)期結(jié)果相符;測序分析發(fā)現(xiàn):結(jié)果與GenBank中IL-7δ4/5基因序列完全一致。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)和IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳證實(shí)其誘導(dǎo)表達(dá)成功。分離純化的包涵體進(jìn)行溶解、稀釋與梯度透析后,IL-7δ4/5蛋白的復(fù)性效率達(dá)到45%,利用親合層析色譜法純化后,蛋白質(zhì)的純度達(dá)到了95%以上,最后用Western Blot法進(jìn)行證實(shí)。2.IL-7δ4/5蛋白對MRC-5細(xì)胞的作用:TGF-β1、IL-7、IL-7δ4/5分別作用于體外培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞,結(jié)果TGF-β1能明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P0.01),明顯誘導(dǎo)細(xì)胞collagen I、α-SMA蛋白表達(dá)的增加(P0.01)。IL-7表現(xiàn)出明顯抑制細(xì)胞增殖(P0.01),降低細(xì)胞collagen I、α-SMA蛋白表達(dá)的作用(P0.01),而IL-7δ4/5對MRC-5細(xì)胞的增殖以及collagenI、α-SMA蛋白的表達(dá)都沒有影響。這表明IL-7δ4/5對于肺纖維化沒有作用。
【關(guān)鍵詞】：缺乏第4和第5外顯子的IL-7剪接變異體 蛋白表達(dá) 活性研究 肺纖維化
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 序言9-14
• 1.1 研究背景9-12
• 1.1.1 剪接變異體的成因9-10
• 1.1.2 選擇性剪接與疾病10
• 1.1.3 白細(xì)胞介素 7（IL-7）10-11
• 1.1.4 白細(xì)胞介素7剪接變異體11-12
• 1.2 研究思路12-14
• 第二章 剪接變異體蛋白rhIL-7δ4/5 的原核表達(dá)、純化以及鑒定14-40
• 2.1 前言14
• 2.2 主要試劑材料14-23
• 2.2.1 細(xì)菌菌種14
• 2.2.2 質(zhì)粒載體14
• 2.2.3 分子生物學(xué)試劑14-15
• 2.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成15
• 2.2.5 相關(guān)儀器15-16
• 2.2.6 主要溶液配制16-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-33
• 2.3.1 感受態(tài)DH5α 及BL21的制備23-24
• 2.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建24-26
• 2.3.3 rhIL-7δ4/5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化、可溶性鑒定26-27
• 2.3.4 rhIL-7δ4/5 蛋白變性與復(fù)性27-29
• 2.3.5 rhIL-7δ4/5 蛋白的純化29-30
• 2.3.6 rhIL-7δ4/5 蛋白Western-blot鑒定30-33
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-37
• 2.4.1 成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒33-34
• 2.4.2 rhIL-7δ4/5 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化、可溶性分析34-36
• 2.4.3 rhIL-7δ4/5 蛋白的復(fù)性及純化36-37
• 2.4.4 Western-blot鑒定rhIL-7δ4/5 蛋白37
• 2.5 討論37-40
• 第三章 rhIL-7δ4/5 蛋白對肺成纖維細(xì)胞株MRC-5 的影響40-55
• 3.1 前言40-41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料41-44
• 3.2.1 細(xì)胞株41
• 3.2.2 主要試劑41
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備41
• 3.2.4 主要溶液配制41-44
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法44-49
• 3.3.1 MRC-5 細(xì)胞培養(yǎng)方法44-45
• 3.3.2 TGF-β1 對MRC-5 增殖及collagenI蛋白、α-SMA蛋白表達(dá)的影響45-48
• 3.3.3 rhIL-7δ4/5 蛋白對MRC-5 增殖及collagenI蛋白、α-SMA蛋白的影響48-49
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-53
• 3.4.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖率49-50
• 3.4.2 Western Blot檢測collagenI蛋白、α-SMA蛋白的表達(dá)50-53
• 3.5 討論53-55
• 全文總結(jié)55-56
• 研究展望56-57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文64-65
• 附錄1 英文縮寫語中文對照65-67
• 致謝67-68

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本文編號：666842